Le plan génétique d'une cellule est codé dans son matériel génétique, ou ADN. Comme l'ADN ne quitte jamais le noyau de la cellule, pour que cette information pénètre dans le cytoplasme où résident d'autres protéines et composants biochimiques, il faut d'abord transcrire l'ADN en ARN messager (ARNm ou ARN poly (A)). Cet ARNm devient alors traduit en protéines qui remplissent de nombreuses fonctions de la cellule. Pour détecter ou quantifier des ARNm très rares, faire des sondes pour des puces à ADN ou construire des banques de molécules d'ADN complémentaires, l'ARNm doit être isolé. Cependant, l'extraction de l'ARN total (c'est-à-dire l'ensemble de l'ARN dans une cellule) et l'isolement subséquent de l'ARNm ne sont pas des processus mutuellement exclusifs; le premier doit être effectué pour l'extraction de l'ARNm.
Isolement de l'ARNm de l'ARN total
Homogénéisation du TRIzol: l'ARN total inclut tous les ARNm, ARN de transfert, ARN ribosomique et autres ARN non codants . Pour séparer ces derniers des autres composants cellulaires, la cellule est d'abord ouverte en éclats pour libérer son contenu. Ceci est fait en remettant en suspension les cellules sédimentées par centrifugation (centrifugation à haute vitesse) dans du réactif TRIzol (Life Technologies). D'autres versions de TRIzol (comme le réactif TRI d'Ambion) fonctionnent de la même façon.
Isolation totale d'ARN: Une série de centrifugations est utilisée pour séparer les différents composants (protéines, ADN, ARN) de la cellule en couches ou phases , dans la suspension. La phase supérieure, de couleur jaune est composée de graisse et peut être jetée. La phase désirée est teintée en rouge, contient l'ARN total et est conservée. Après avoir effectué une extraction au phénol-chloroforme et une série de lavages à l'alcool en utilisant de l'isopropanol et de l'éthanol, l'ARN peut être granulé pour l'isolement de l'ARNm. Ajouter des inhibiteurs de RNase pour empêcher cette enzyme de dégrader l'ARN total.
Extraction d'ARNm: Il est courant d'utiliser un kit pour isoler les ARNm, car les protocoles de laboratoire maison ne génèrent pas de grandes quantités d'ARNm hautement purifiés. Les trousses commerciales comprennent FastTrack 2.0 d'Invitrogen ou le kit d'isolation d'ARNm Poly (A) Pure d'Ambion. Ces étapes de base sont communes à de tels kits:
a) Mélanger le tampon de lyse inhibé par la RNase fourni dans le kit avec jusqu'à 300 microlitres d'ARN total.
Chauffer pendant 5 minutes à 65 degrés Celsius, puis refroidir immédiatement l'échantillon sur de la glace pendant une minute.
c) Mélanger avec du chlorure de sodium 0,5 M puis dissoudre complètement l'Oligo dT (acide oligodésoxythymidylique) dans cet échantillon.
d) Centrifuger cet échantillon et récupérer le surnageant, qui est lavé plusieurs fois dans une série de tampons de liaison et à faible teneur en sel fournis dans les kits. f) Précipiter l'éluat par précipitation à l'acétate de sodium et à l'éthanol. Remettre en suspension jusqu'à 20 microlitres d'eau traitée au diéthylpyrocarbonate (DEPC). g) Stocker à -80 degrés Celsius et vérifier la qualité et la quantité par spectrophotométrie. Astuce Conservez tous les réactifs, les cellules et l'ARN à froid en les immergeant dans la glace. Cela empêche l'ARN d'être dégradé par d'autres enzymes qui se libèrent pendant le processus d'homogénéisation. Avertissement Les réactifs tels que TRIzol sont toxiques et ne doivent pas être en contact avec la peau ou les muqueuses. Respectez toujours les protocoles de laboratoire sécuritaires lors de la manipulation de ce réactif.
