Lorsqu’elles sont activées par un laser et visualisées à travers un microscope haute puissance, ces étiquettes ou étiquettes fluorophores explosent dans un arc-en-ciel de couleurs et d’informations. Ils fournissent une multitude d'informations qui peuvent, par exemple, aider à détecter des maladies ou à identifier des conditions génétiques.

Pour détecter plusieurs types de molécules à la fois, ou mesures « multiplexes », des types supplémentaires de fluorophores émettant différentes couleurs de lumière sont utilisés. Mais il est étonnamment difficile de distinguer les différentes couleurs au niveau d’une seule molécule. C'est pourquoi la plupart des microscopes n'examinent que trois à quatre couleurs.

Les chercheurs peuvent briser cette barrière de couleur en utilisant des techniques avancées qui impliquent des cycles d’étiquetage et d’imagerie de plusieurs jours ou en utilisant des configurations complexes avec de nombreux lasers. Cependant, trouver un moyen simple et rapide de voir de nombreuses couleurs reste un défi majeur.

Des chercheurs de la Pritzker School of Molecular Engineering d'UChicago ont trouvé une nouvelle solution à ce défi, décrite dans un article publié aujourd'hui dans Nature Nanotechnology. . Une nouvelle technique décrite par le Squires Lab utilise trois éléments chimiques simples pour concevoir des dizaines d'étiquettes « FRETfluor », créant ainsi un spectre de couleurs plus beau et plus nuancé que les chercheurs peuvent utiliser pour étiqueter les biomolécules.

"Notre approche est plus simple. Il s'agit d'une seule photo d'étiquetage, d'une seule photo d'imagerie", a déclaré le co-premier auteur Jiachong Chu, titulaire d'un doctorat en génie moléculaire à l'UChicago Pritzker. candidat. "Cela signifie que vous pouvez faire plus avec moins. Actuellement, notre nouvelle technique est la meilleure dans le domaine."

Une nouvelle voie vers le multiplexage

Les molécules individuelles sont petites et les échantillons de cellules sont relativement énormes, compliqués et désordonnés. L'objectif ultime de ce domaine de recherche, que l'article de l'équipe PME rapproche plus que jamais, est le multiplexage.

"Multiplexer des échantillons signifie pouvoir, dans la même mesure, mesurer plus d'une espèce de molécule, donc peut-être avoir 10 ou 50, ou des centaines de protéines différentes que vous souhaitez identifier", a déclaré Allison, professeur adjoint de génie moléculaire de la famille Neubauer. Écuyers. "Avec cette nouvelle technique, nous pouvons en faire des dizaines. Je pense que nous pouvons étendre cela à des centaines."

Pour relever ce défi, l'équipe du Squires Lab a trouvé une nouvelle façon innovante d'utiliser une technique bien établie :le transfert d'énergie par résonance de Förster ou FRET. FRET est un mécanisme qui décrit la façon dont l'énergie est transférée entre les molécules sensibles à la lumière. C'est une façon pour les chercheurs de mesurer la distance entre différentes parties d'une molécule ou de signaler le moment où deux molécules interagissent. Les signaux FRET sont exceptionnellement sensibles aux propriétés des fluorophores participants, que l'équipe d'UChicago a utilisés pour régler leurs étiquettes FRETfluor.

"Ce projet utilise FRET d'une nouvelle manière", a déclaré Ayesha Ejaz, co-premier auteur et titulaire d'un doctorat. candidat en chimie. "FRET est couramment utilisé pour mesurer les distances et observer la dynamique des biomolécules. Nous avons modifié l'espacement entre un colorant donneur et accepteur pour créer différentes efficacités de FRET et d'autres propriétés que nous utilisons pour identifier les différentes constructions."

Les 27 tags utilisés dans les recherches de l'équipe PME étaient 27 « FRETfluors » conçus à partir d'une simple combinaison d'ADN, d'un colorant cyanine vert (Cy3) et d'un colorant cyanine rouge (Cy5). En plus de briller de différentes couleurs, les FRETfluors présentent chacun d'autres propriétés réglables telles que le moment de l'émission des photons ou l'orientation de ces photons.

Ensemble, ces propriétés peuvent être utilisées pour identifier un FRETfluor en seulement une fraction de seconde, à des concentrations ultra-faibles. Ejaz a déclaré qu'une direction future possible pour cette recherche serait de remplacer à terme les étiquettes fluorophores ordinaires par ces FRETfluors.

"Habituellement, lorsque les gens veulent examiner plusieurs choses, comme différentes parties d'une cellule, à la fois, ils étiquettent chaque composant avec une étiquette fluorescente différente qui émet une certaine couleur de lumière. Mais les étiquettes fluorescentes sont limitées à quatre ou cinq couleurs. ", a déclaré Ejaz.

"Si les FRETfluors peuvent être utilisés à la place, nous pourrons alors augmenter le nombre de "couleurs" disponibles pour la microscopie à fluorescence. Nous testons actuellement l'efficacité des FRETfluors dans différents types d'expériences et d'environnements, ce qui nous permettra de mieux comprendre tous les possibilités."

"Je suis ravie de voir les FRETfluors en action", a-t-elle déclaré.

Sensibilité et simplicité

Pour Squires, une grande partie de l'attrait de la nouvelle technique de multiplexage vient de la sensibilité combinée à la simplicité.

"Tout le monde veut multiplexer son test préféré, et il existe de nombreuses stratégies existantes qui fonctionneront dans certaines situations", a-t-elle déclaré. "Il existe des techniques qui fonctionnent bien lorsque vous disposez de beaucoup de temps, ou lorsque votre échantillon est mort et que rien ne bouge.

"Nous attaquons le problème là où vous n'avez pas beaucoup de temps. Vous voulez savoir de quelle maladie quelqu'un est atteint pendant qu'il est encore temps de la combattre, ou vous n'avez qu'un tout petit échantillon et vous obtenez une seule injection pour l'identifier. chaque molécule lorsqu'elle circule dans votre canal. Nous pouvons identifier les FRETfluors en une fraction de seconde jusqu'à des dizaines de concentrations femtomolaires. "

La simplicité est la clé, à la fois en utilisant des produits chimiques courants pour fabriquer les FRETfluors et en inventant une technique qui ne nécessite qu'un seul laser pour la lecture.

"Nous n'étiquetons la cible qu'une seule fois et ne faisons la lecture qu'une seule fois", a déclaré Chu. "Dans ce contexte, nous pouvons créer 27 balises différentes pouvant être utilisées en même temps."

Squires a décrit comment les techniques existantes pourraient être utilisées avec les FRETfluors pour obtenir davantage de gains de multiplexage :"vous pourriez introduire des schémas d'excitation laser sophistiqués ou incorporer d'autres fluorophores ayant des propriétés légèrement différentes" - qui amélioreraient les lectures des étiquettes existantes.

Selon Squires, l'application de ces multiplicateurs à leur nouvelle technique plus puissante peut ouvrir la voie à de nouvelles recherches et applications.

"Ces améliorations de l'imagerie et des tests biomédicaux basés sur le flux permettront la prochaine génération d'innovation", a déclaré Squires.