Illustration schématique de l'auto-assemblage déclenché par NTR de NBC-Iod-CBT en Iod-CBT-NPs à l'intérieur d'une cellule. Sous réduction du glutathion (GSH) et clivage de la nitroréductase (NTR), La petite molécule 4-nitrobenzyl carbamate–Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(iode)–2-cyano-benzothiazole (NBC-Iod-CBT) subit une réaction de condensation intracellulaire CBT-Cys click et s'auto-assemble en nanoparticules iodées (c'est à dire, Iod-CBT-NPs). Crédit :Avancées scientifiques, doi:10.1126/sciadv.aba3190
Il est actuellement difficile d'observer directement la formation de nanostructures intracellulaires en laboratoire. Dans un nouveau rapport, Miaomiao Zhang et une équipe de recherche en chimie, sciences de la vie, génie médical et science et technologie, en Chine, a utilisé une petite molécule de conception rationnelle abrégée NBC-Iod-CBT (abréviation de 4-nitrobenzyl carbamate–Cys(SEt)-Asp-Asp-Phe(iode)–2-cyano-benzothiazole) et a observé directement la formation de nanoparticules intracellulaires avec la tomographie nanométrique ( nano-CT).
Lors des expérimentations, les mécanismes de réduction du glutathion (GSH) et de clivage de la nitroréductase (NTR) ont amené les molécules NBC-Iod-CBT à subir une réaction de condensation par clic et à s'auto-assembler sous forme de Iod-CBT-NP. Lorsque l'équipe a réalisé une imagerie nano-CT de NBC-Iod-CBT traité, cellules HeLa exprimant la nitroréductase en laboratoire, ils ont montré l'existence d'Iod-CBT-NPs auto-assemblés dans leur cytoplasme. La nouvelle stratégie est maintenant publiée sur Avancées scientifiques et aidera les scientifiques du vivant et les bioingénieurs à comprendre les mécanismes de formation des nanostructures intracellulaires.
Une stratégie intelligente pour le nanoassemblage
L'assemblage de nanostructures à l'aide de petits précurseurs moléculaires à l'intérieur des cellules est une stratégie intelligente présentant de grands avantages en imagerie moléculaire et en administration de médicaments. Les petites molécules peuvent être facilement absorbées par les cellules, mais ils sont également éliminés rapidement. En revanche, les nanostructures avec des agents thérapeutiques ont des délais de rétention plus longs dans les cellules avec une puissance plus élevée. Néanmoins, il est beaucoup plus difficile pour une cellule d'occuper une nanostructure qu'une petite molécule. Les scientifiques activent donc les nanostructures pour l'absorption cellulaire en modifiant la surface cellulaire avec le ciblage des « ogives, ' mais de telles modifications peuvent réduire la reproductibilité du nanocomplexe. Par conséquent, une méthode intelligente récemment développée vise à former des nanoparticules intracellulaires, où les cultures cellulaires incubées avec un petit précurseur moléculaire auront une nanostructure en elles, pour des applications passionnantes dans l'imagerie moléculaire et l'administration de médicaments. Cependant, il est encore difficile de différencier les nanostructures artificiellement formées des structures cellulaires intrinsèques. Pour y parvenir, Zhang et al. a d'abord conçu un précurseur de petite molécule contenant de l'iode (iode), ils ont ensuite soumis le composé à un auto-assemblage induit par une enzyme intracellulaire pour former les nanoparticules d'intérêt et ont utilisé la nano-CT (tomographie par nanoordinateur) pour observer les nanoparticules intracellulaires.
Caractérisations in vitro des Iod-CBT-NPs. (A) image TEM de Iod-CBT-NPs. (B) Traces HPLC de 500 M NBC-Iod-CBT (noir), 500 M de NBC-Iod-CBT incubés avec du TCEP (2 mM) pendant 1 heure, et une incubation supplémentaire avec du NADH (5 mM) et du NTR (5 U/ml) pendant 2 heures dans du PBS 10 mM à 37°C (rouge). Longueur d'onde pour la détection :320 nm. (C) Image de projection 2D de Iod-CBT-NPs. (D) Image de rendu 3D de Iod-CBT-NPs (jaune). LAC, coefficient d'absorption linéaire. Crédit :Avancées scientifiques, doi:10.1126/sciadv.aba3190 
La petite structure moléculaire iodée NBC-Iod-CBT avait une conception rationnelle constituée de quatre parties, qui comprenait
Lorsque le composé est entré dans les cellules cancéreuses hypoxiques (privées de niveaux adéquats d'oxygène) surexprimant la nitroréductase (NTR), ils ont subi un auto-assemblage pour former des nanoparticules (NP) appelées Iod-CBT-NP. Pour induire la formation de nanoparticules déclenchée par la nitroréductase (NTR) en laboratoire, les scientifiques ont incubé la petite molécule NBC-Iod-CBT avec des solutions salines tamponnées et ajouté la solution de nitroréductase pendant deux heures pour former des nanostructures avec des absorbances visibles comprises entre 500 et 700 nm.
Image MET d'une cellule HeLa d'hypoxie traitée par NBC-Iod-CBT. (A) Image TEM à faible grossissement de la cellule d'hypoxie HeLa incubée avec 250 M de NBC-Iod-CBT pendant 4 heures. (B) Image TEM à fort grossissement de la zone du carré rouge en (A). Crédit :Avancées scientifiques, doi:10.1126/sciadv.aba3190
Lorsque Zhang et al. ajouté un inhibiteur de nitroréductase connu sous le nom de dicoumarine à la solution, les absorbances visibles des mélanges ont diminué, confirmant la formation de nanostructures en présence de nitroréductase. A l'aide d'images de microscopie électronique à transmission, l'équipe a observé l'apparition de nanoparticules et a utilisé la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) et la spectrométrie de masse à désorption/ionisation laser assistée par matrice haute résolution pour confirmer la formation d'Iod-CBT-NPs. Zhang et al. ensuite utilisé des images nano-CT tridimensionnelles (3-D) du mélange avec un nano-CT de microscopie à rayons X doux pour finalement reconstruire les images nano-CT 3-D, où différents constituants du composé présentaient différentes capacités d'absorption des rayons X. De cette façon, l'expérience a permis au composé d'intérêt NBC-Iod-CBT de subir un auto-assemblage déclenché par NTR pour former les nanoparticules attendues (Iod-CBT-NPs) en laboratoire.
Formation intracellulaire d'Iod-CBT-NPs et imagerie nano-CT en microscopie à rayons X mous
Zhang et al. ont ensuite étudié le même processus expérimental pour induire l'auto-assemblage de nanoparticules à l'intérieur des cellules. Le composé d'intérêt (NBC-Iod-CBT) avait une sélectivité plus élevée envers la nitroréductase, pour éviter ainsi d'éventuelles interférences intracellulaires en présence d'autres constituants intracellulaires tels que les biothiols, oxydants et acides aminés. Les cellules cancéreuses du col de l'utérus humain HeLa surexpriment généralement la nitroréductase (NTR) dans des conditions hypoxiques (privées de niveaux adéquats d'oxygène), atteignant les niveaux expérimentaux les plus élevés en huit heures. Lorsque Zhang et al. cellules HeLa hypoxiques incubées avec la petite molécule NBC-Iod-CBT, ils ont observé la formation éventuelle de nanoparticules au sein des cellules HeLa hypoxiques. En utilisant des images de microscopie électronique des cellules, ils ont montré l'existence des nanoparticules comme attendu dans le cytoplasme cellulaire.
Pour observer directement les nanoparticules d'intérêt (Iod-CBT-NP) à l'intérieur des cellules, l'équipe a traité expérimentalement les cellules HeLa hypoxiques et les a imagées à l'aide de la microscopie à rayons X mous nano-CT. Ils ont ensuite utilisé des cellules HeLa hypoxiques prétraitées avec de la dicoumarine ou de la normoxie (niveaux normaux d'oxygène) comme deux témoins positifs et des cellules HeLa hypoxie ou normoxie non traitées comme deux témoins négatifs. Les résultats ont indiqué la formation des nanoparticules Iod-CBT dans le cytoplasme des cellules HeLa hypoxiques. Lorsqu'ils ont soumis ces cellules à un traitement par inhibiteur de la nitroréductase, le contraste CT du cytoplasme a diminué. L'équipe a reconstruit des projections 2D des cellules pour obtenir des images nanoCT 3D. En utilisant le coefficient d'absorption linéaire (LAC) ou le coefficient d'atténuation linéaire, Zhang et al. a confirmé la faisabilité de la formation de nanoparticules intracellulaires.
Iod-CBT-NPs directement observés avec imagerie nano-CT en microscopie à rayons X doux. (A) Les images de projection 2D de cellules HeLa hypoxiques traitées avec 250 M de NBC-Iod-CBT pendant 4 heures (à gauche), cellules HeLa hypoxiques traitées avec 500 M de dicoumarine (un inhibiteur de NTR) puis traitées avec 250 M de NBC-Iod-CBT pendant 4 heures (milieu), et des cellules HeLa normales traitées avec 250 M de NBC-Iod-CBT pendant 4 heures (à droite). (B) Absorptions absolues de rayons X mous correspondantes pour les lignes rouges dans la partie (A). (C) Cellules HeLa segmentées 3D correspondantes dans (A). Dans les régions segmentées, les structures jaunes sont des Iod-CBT-NPs, les structures vertes sont le cytoplasme, et les structures bleues sont le noyau. (D) Vue agrandie de la zone du rectangle rouge dans la partie (C). (E) Histogramme LAC d'Iod-CBT-NPs intracellulaires entiers [les structures jaunes dans l'image de gauche de (C)] et sa courbe d'ajustement gaussienne correspondante (noir). Crédit :Avancées scientifiques, doi:10.1126/sciadv.aba3190 
De cette façon, Miaomiao Zhang et ses collègues ont conçu de manière rationnelle une construction NBC-Iod-CBT à petite molécule iodée pour former et observer directement des nanoparticules à l'intérieur des cellules à l'aide de nano-CT. Après des expériences de première main menées in vitro, l'équipe a mené d'autres études dans le cytoplasme des cellules HeLa exprimant la nitroréductase. En utilisant des techniques analytiques, l'équipe a montré la formation de nanoparticules (Iod-CBT-NP) dans les petites cellules hypoxiques HeLa traitées par NBC-Iod-CBT. Ils ont vérifié leur méthode en utilisant le coefficient d'absorption linéaire et ont confirmé la faisabilité de la formation de nanoparticules intracellulaires. Ce travail aidera les chercheurs à mieux comprendre la formation de nanostructures intracellulaires avec des applications importantes en nanomédecine et en bio-ingénierie.
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