Cette image représente le système de livraison/d'échantillonnage. Crédit:Northwestern McCormick School of Engineering
Les lignées cellulaires injectées avec de l'acide nucléique libre sont largement utilisées pour la découverte de médicaments et la modélisation de maladies. Pour éviter les populations cellulaires génétiquement mélangées, les chercheurs utilisent des techniques de dilution pour sélectionner des cellules individuelles qui généreront ensuite des lignées identiques. Cependant, la voie des dilutions limites est fastidieuse et chronophage.
Une nouvelle étude menée par des chercheurs de Northwestern montre comment l'électroporation par sonde à nanofontaine (NFP-E), un outil qui délivre des molécules dans des cellules individuelles, pourrait résoudre ce problème, et pourrait conduire à de nouvelles applications pour le dépistage des médicaments et la conception de traitements spécifiques aux patients.
L'équipe, dirigé par Horacio Espinosa de Northwestern Engineering et incluant Joshua Leonard, démontre la polyvalence de la NFP-E, qui introduit de l'ADN ou de l'ARN dans les cellules en utilisant l'électricité. Il peut également fournir à la fois des protéines et des plasmides dans une variété de types de cellules animales et humaines avec un contrôle de la posologie. L'équipe comprenait John Kessler, le professeur Ken et Ruth Davee de biologie des cellules souches et professeur de neurologie et de pharmacologie à la Northwestern University Feinberg School of Medicine.
La nouvelle méthode peut être utilisée pour étudier la maladie ou pour la thérapie cellulaire. Dans l'ancien, le génome est manipulé. Dans ce dernier, l'édition de gènes se produit dans des cellules telles que les lymphocytes T pour traiter le cancer avec des immunothérapies.
En utilisant l'électroporation monocellulaire, le processus d'introduction d'ADN ou d'ARN dans des cellules individuelles à l'aide d'une impulsion électrique, qui ouvrent brièvement les pores de la membrane cellulaire, leurs travaux montrent comment la NFP-E contrôle finement l'expression relative de deux plasmides co-transfectés. De plus, en associant électroporation monocellulaire et imagerie fluorescente time-lapse, leur enquête révèle des temps caractéristiques pour la fermeture des électropores.
Le prélèvement avant électroporation. Crédit:Northwestern McCormick School of Engineering
« Nous avons démontré le potentiel de la technologie NFP-E dans la manipulation d'une variété de types de cellules avec un contrôle stoechiométrique de la cargaison moléculaire qui peut être utilisé pour mener un large éventail d'études dans le criblage de médicaments, thérapies cellulaires, et la biologie synthétique, " dit Espinosa, James N. et Nancy J. Farley Professeur de fabrication et d'entrepreneuriat et professeur de génie mécanique et (par courtoisie) de génie biomédical et de génie civil et environnemental.
Actuellement, les biomolécules peuvent être délivrées dans les cellules de nombreuses manières :vecteurs viraux; transporteurs chimiques, tels que les peptides à pénétration cellulaire et les nanocapsules polymères; lipofectamine, et électroporation en vrac.
« Il existe un certain nombre de stratégies pour délivrer des biomolécules dans les cellules, mais chacun a ses limites, " dit Léonard, professeur agrégé de génie chimique et biologique et professeur d'excellence en enseignement Charles Deering McCormick. "Par exemple, les vecteurs chimiques confèrent une délivrance relativement lente et peuvent être toxiques pour la cellule; les vecteurs viraux sont souvent efficaces mais peuvent induire des réponses immunitaires défavorables et une génotoxicité d'insertion. L'utilisation de toute méthode traditionnelle nécessite souvent des efforts importants pour optimiser le protocole en fonction du type cellulaire et de la molécule à délivrer, et, donc, une stratégie de livraison de biomolécules facilement généralisable offrirait des avantages significatifs. »
Le nouveau système NFP-E permet l'administration unicellulaire d'ADN, ARN, et des protéines dans différentes lignées cellulaires immortalisées ainsi que des cellules primaires avec plus de 95 pour cent d'efficacité et plus de 90 pour cent de viabilité cellulaire.
"Les résultats indiquent que le temps de refermeture de la membrane cellulaire évolue de manière non linéaire avec la tension d'impulsion et le nombre d'impulsions d'électroporation, atteindre un maximum aux valeurs intermédiaires, " a déclaré Espinosa. "Cela signifie que des temps de pulsation longs ou des tensions élevées ne semblent pas nécessaires pour un transport moléculaire efficace à travers les membranes cellulaires. Cette caractéristique est importante pour obtenir une efficacité de transport élevée tout en maintenant la toxicité cellulaire au minimum. »
Le prélèvement après électroporation. Crédit:Northwestern McCormick School of Engineering
En utilisant la technologie d'électroporation à cellule unique, les chercheurs ont pu comprendre les mécanismes de transport impliqués dans l'échantillonnage cellulaire localisé basé sur l'électroporation. Un obstacle à l'échantillonnage unicellulaire temporel non destructif est les petites quantités de cytosol - le fluide à l'intérieur des cellules - qui sont extraites, ce qui rend difficile le test ou la détection de séquences d'ARN ou de protéines.
Les recherches ont montré que la mise à l'échelle du temps de refermeture de la membrane est fonction de divers paramètres d'électroporation, fournissant un aperçu de la dynamique des électropores post-impulsion.
"Le travail répond au besoin de comprendre les moyens d'augmenter la quantité de cytosol échantillonnée, sans nuire aux cellules, " Espinosa a déclaré. "Cela peut guider la communauté des chercheurs dans la conception d'expériences visant à l'échantillonnage basé sur l'électroporation de molécules intracellulaires pour l'analyse cellulaire temporelle."
Cette recherche est liée à des travaux antérieurs qui ont développé une méthode peu invasive pour échantillonner des cellules qui peut être répétée plusieurs fois. Cette enquête antérieure, qui utilisait des impulsions électriques pour extraire les enzymes du cytosol, aide à la compréhension de la cinétique de formation et de fermeture des pores.
Le papier, "Nanofountain Probe Electroporation Enables Versatile Single-Cell Intracellular Delivery and Investigation of Postpulse Electropore Dynamics" a été publié le 2 octobre dans la revue Petit .
