Luminescence des UCNP. une, Schéma de conversion ascendante du transfert d'énergie avec Yb3+ comme sensibilisateur et Er3+ comme émetteur. b, Intensités d'excitation maximales minimales de la lumière NIR nécessaires pour l'imagerie multiphotonique d'une molécule unique de diverses classes de sondes luminescentes. Les plages d'intensité d'excitation de crête indiquées sont nécessaires pour détecter des signaux de 100 c.p.s. Crédit :Avec l'aimable autorisation de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, et P. James Schuck, La Fonderie Moléculaire, Laboratoire national Lawrence Berkeley
Lors de l'imagerie au niveau d'une molécule unique, de petites irrégularités connues sous le nom d'hétérogénéités deviennent apparentes - des caractéristiques qui sont perdues à plus grande échelle, imagerie dite d'ensemble. À la fois, il a été jusqu'à récemment difficile de développer des sondes luminescentes avec la photostabilité, luminosité et émission continue nécessaires à la microscopie à molécule unique. Maintenant, cependant, scientifiques de la fonderie moléculaire du Lawrence Berkeley National Lab, Berkeley, CA ont développé conversion ascendante des nanoparticules (UCNPs) de moins de 10 nm de diamètre dont la luminosité en imagerie monoparticulaire dépasse celle des matériaux existants de plus d'un ordre de grandeur. Les chercheurs déclarent que leurs découvertes permettent une gamme d'applications possibles, y compris cellulaire et in vivo imagerie, ainsi que des rapports sur les propriétés électromagnétiques locales de champ proche de nanostructures complexes.
Le Dr P. James Schuck a discuté de l'article qu'il, Dr Bruce E. Cohen, Dr Daniel J. Gargas, Dr Emory M. Chan, et leurs co-auteurs publiés dans Nature Nanotechnologie , à commencer par les principaux défis rencontrés par les scientifiques dans :
"Les émetteurs les plus couramment utilisés pour l'imagerie de molécules uniques - les colorants organiques et les points quantiques - ont des limitations importantes qui se sont avérées extrêmement difficiles à surmonter, " Schuck raconte Phys.org. Il explique que les colorants organiques sont généralement les plus petites sondes (typiquement ~ 1 nm de taille), et s'allumera et s'éteindra au hasard. Ce "clignotement" est assez problématique pour l'imagerie de molécule unique, il continue, et généralement après avoir émis environ 1 million de photons sera toujours photoblanchiment - C'est, s'éteindre définitivement. "Cela peut sembler beaucoup de photons au début, " Schuck dit, "Mais cela signifie que les colorants cessent d'émettre après seulement environ 1 à 10 secondes dans la plupart des conditions d'imagerie. Les UCNP ne clignotent jamais."
De plus, Schuck continue, il s'avère que les mêmes problèmes existent pour les points quantiques fluorescents, ou Qdots , également. Cependant, alors qu'il est possible de faire des Qdots qui ne clignoteront pas ou ne photoblanchiront pas, cela nécessite généralement l'ajout de couches au Qdot, ce qui les rend trop grandes pour de nombreuses applications d'imagerie. (Un point quantique est un nanocristal semi-conducteur suffisamment petit pour présenter des propriétés mécaniques quantiques.) "Nos nouveaux UCNP sont petits, et ne clignez pas des yeux et ne blanchissez pas."
En raison de ces propriétés, note-t-il, Les UCNP ont récemment suscité un grand intérêt car ils ont le potentiel d'être des marqueurs et des sondes luminescents idéaux pour l'imagerie optique - mais le principal obstacle à la réalisation de leur potentiel a été l'incapacité de concevoir des UCNP de moins de 10 nm suffisamment brillants pour être imagés au même endroit. niveau UCNP.
Intensité et hétérogénéité de la luminescence dépendantes de la taille de l'UCNP. une, Déviation de l'intensité de luminescence UCNP unique normalisée au volume des particules par rapport à l'échelle volumétrique idéale (n¼300 au total). La courbe représente l'intensité calculée normalisée au volume pour les UCNP avec une couche de surface non luminescente de 1,7 nm. Seules les intensités de single, nanocristaux non agrégés, comme déterminé par la Fig. 5 supplémentaire, sont utilisés. L'encart supérieur montre un diagramme représentant un nanocristal idéal dans lequel avec tous les émetteurs inclus sont luminescents (cercles verts). L'encart inférieur est un diagramme représentant un nanocristal avec des émetteurs non luminescents (cercles marrons) dans une couche de surface externe. b, Spectres fins des bandes d'émission vertes collectées à partir de quatre UCNPs simples de 8 nm (courbes 1 à 4) et leurs spectres moyennés (courbe Sigma). Crédit :Avec l'aimable autorisation de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, et P. James Schuck, La Fonderie Moléculaire, Laboratoire national Lawrence Berkeley
"Cela m'amène à ce qui est probablement le plus important à retenir de notre travail, qui est la découverte et la démonstration de nouvelles règles pour concevoir l'ultrabright, sondes monomoléculaires ultra petites UCNP, " dit Schuck. De plus, il souligne que ces nouvelles règles contrastent directement avec les méthodes conventionnelles de création de UCNP brillants. "Comme nous l'avons montré dans notre article, nous avons synthétisé et imagé des UCNP aussi petits qu'une seule protéine fluorescente ! Pour de nombreuses applications de bio-imagerie, des sondes luminescentes très petites - certainement inférieures à 10 nm - sont nécessaires car vous avez vraiment besoin de l'étiquette ou de la sonde pour perturber le moins possible le système qu'elles sondent."
Schuck mentionne un autre avantage de la conversion ascendante des nanoparticules - à savoir, ils fonctionnent en absorbant au moins deux photons infrarouges et en émettant une lumière visible de plus haute énergie. « Comme presque tous les autres matériaux ne sont pas convertis, lors de l'imagerie des UCNP dans un échantillon, il n'y a presque pas d'autre fond autofluorescent provenant de l'échantillon. Cela se traduit par un bon contraste d'imagerie et des niveaux élevés de signal sur fond. tandis que les colorants organiques et les Qdots peuvent également absorber la lumière infrarouge et émettre une lumière à plus haute énergie via un processus d'absorption non linéaire de deux photons, les puissances d'excitation nécessaires pour générer des signaux de fluorescence à deux photons mesurables dans les colorants et les petits Qdots sont de plusieurs ordres de grandeur plus élevés que ce qui est nécessaire pour générer une luminescence convertie à partir des UCNP. "Ces puissances élevées sont généralement mauvaises pour les échantillons et une grande préoccupation dans les communautés de bio-imagerie", souligne Schuck, "où ils peuvent entraîner des dommages et la mort cellulaire."
Schuck note que deux autres aspects clés au cœur des découvertes mentionnées dans l'article - l'utilisation de la caractérisation avancée d'une seule particule, et la modélisation théorique – étaient une conséquence de l'environnement de collaboration multidisciplinaire à la Fonderie. "Cette étude nous a demandé de combiner la photophysique à molécule unique, la capacité de synthétiser des nanocristaux à conversion ascendante ultrapetits de presque toutes les compositions, et la modélisation et la simulation avancées des propriétés optiques de l'UCNP, « Il est difficile de simuler et de modéliser avec précision le comportement photophysique de ces matériaux en raison du grand nombre de niveaux d'énergie dans ces matériaux qui interagissent tous de manière complexe, et Emory Chan a développé un modèle unique qui représente objectivement tous les plus de 10, 000 transitions de collecteur à collecteur dans la plage d'énergie autorisée."
Précédemment, Schuck dit que la sagesse conventionnelle pour concevoir des UCNPs brillants avait été d'utiliser une concentration relativement faible d'ions émetteurs dans les nanoparticules, étant donné que trop d'émetteurs entraîneront une diminution de la luminosité en raison des effets d'auto-extinction une fois que la concentration de l'émetteur UCNP dépasse ~1%. « Cela s'avère être vrai si vous voulez créer des particules brillantes dans des conditions d'imagerie d'ensemble, c'est-à-dire où une puissance d'excitation relativement faible est utilisée - puisque vous avez de nombreuses particules signalant collectivement, " Schuck explique. " Cependant, cela se décompose dans des conditions d'imagerie à molécule unique. » Dans leur article, les chercheurs ont démontré que sous les puissances d'excitation plus élevées utilisées pour l'imagerie de particules uniques, les niveaux d'énergie pertinents deviennent plus saturés et l'auto-extinction est réduite. "Par conséquent, " Schuck continue, "vous voulez inclure dans vos UCNP une concentration d'ions émetteurs aussi élevée que possible." Il en résulte que les nanoparticules sont presque non luminescentes dans des conditions d'ensemble de faible puissance d'excitation en raison d'une auto-extinction importante, mais ultra-lumineux dans des conditions d'imagerie à molécule unique.
Configuration expérimentale pour la caractérisation optique UCNP unique. Un laser de 980 nm est préfocalisé avec un objectif de 500 mm avant d'entrer dans l'ouverture arrière d'un objectif 0.95 NA 100x (Zeiss), qui ajuste le plan focal du laser au plus près de celui de la luminescence visible (ligne pointillée). La lumière émise est récupérée à travers le même objectif, filtré par deux filtres passe-court 700nm et deux filtres passe-long 532nm (Chroma) pour éliminer la lumière laser résiduelle, et focalisé sur un APD à comptage de photons (MPD) ou acheminé vers un spectromètre CCD refroidi par LN (Princeton Instruments) avec un réseau de 1200 rainures/mm. Un compteur de photons uniques à corrélation temporelle (Picoquant) est utilisé pour les mesures de durée de vie de la luminescence. Toutes les expériences ont été réalisées dans des conditions ambiantes à 106/cm2, sauf indication contraire. Les données dépendantes de la puissance et les coupes de lignes de particules uniques illustrées à la figure 4 ont été collectées avec un objectif à immersion d'huile 1,4 NA 100x (Nikon). Crédit :Avec l'aimable autorisation de Daniel Gargas, Emory Chan, Bruce Cohen, et P. James Schuck, La Fonderie Moléculaire, Laboratoire national Lawrence Berkeley
Une autre implication importante de cette découverte, Schuck ajoute, est que cela devrait changer la façon dont les gens rechercheront les meilleures sondes luminescentes à molécule unique à l'avenir. "Jusqu'à maintenant, " note-t-il, "les gens regarderaient d'abord quelles sondes étaient lumineuses en utilisant des conditions au niveau de l'ensemble, puis étudierait uniquement ce sous-ensemble en tant que sondes à molécule unique possibles. Nos nouvelles sondes seraient, bien sûr, ont échoué à ce test de dépistage !"
Schuck souligne à nouveau que « l'une des principales raisons pour lesquelles cette découverte s'est produite est que nous avons des experts dans tous les domaines clés dans le même bâtiment, et nous avons pu parcourir rapidement le cycle théorie-synthèse-caractérisation."
Concernant les futures directions de recherche, note Schuck, les scientifiques poursuivent quelques voies différentes. "Nous aimerions certainement maintenant utiliser ces UCNP nouvellement conçus pour la bio-imagerie... jusqu'à présent, nous n'avons étudié les propriétés photophysiques fondamentales de ces particules que lorsqu'elles sont isolées sur du verre. Nous pensons qu'une application passionnante et importante sera leur utilisation dans l'imagerie cérébrale - en particulier pour les tissus profonds in vivo imagerie optique des neurones et de la fonction cérébrale.
En terminant, Schuck mentionne d'autres domaines de recherche qui pourraient bénéficier de leur étude. "Je pense qu'une application principale est le suivi d'une seule particule dans les cellules. Par exemple, " illustre-t-il, "étiqueter des protéines spécifiques avec des UCNP individuels et les suivre pour comprendre leur cinétique cellulaire."
Selon des lignes différentes, Schuck ajoute, il s'avère que les UCNPs sont aussi d'excellentes sondes de champs électromagnétiques très locaux. "C'est parce que les lanthanides ont un ensemble assez unique de propriétés photophysiques telles que l'émission dipolaire magnétique relativement répandue, nous permettant de sonder les champs magnétiques optiques, et des durées de vie très longues telles que les transitions ne sont pas fortement autorisées, ce qui nous permet de sonder plus facilement les effets optiques quantiques de la cavité tels que l'amélioration de l'émission de Purcell. En réalité, Schuck conclut, une expérience qui utilise les UCNP pour rendre compte des intensités de champ proche et des distributions de champ entourant les dispositifs nanoplasmoniques est en cours."
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