Les chimistes utilisent la chromatographie liquide haute performance, ou HPLC, pour séparer les mélanges de composés. En général, la méthode consiste à injecter un échantillon dans une colonne où il se mélange avec un ou plusieurs solvants. Différents composés s'adsorbent, ou "collent", à la colonne à des degrés différents; et comme le solvant pousse les composés à travers la colonne, l'un des composants du mélange sortira d'abord de la colonne. L'instrument détecte les composés lorsqu'ils sortent de la colonne et produit un chromatogramme qui consiste en un tracé avec le temps de rétention sur l'axe des abscisses et l'intensité du signal provenant du détecteur sur l'axe des ordonnées. Lorsque les composés quittent la colonne, ils produisent des "pics" dans le chromatogramme. En général, plus les pics du chromatogramme sont éloignés et plus la résolution est élevée. Les scientifiques considèrent une résolution de 1,0 ou supérieure pour représenter une séparation adéquate.
Mesurez la largeur de deux pics adjacents dans le chromatogramme en notant où se trouvent les valeurs de l'axe des x à la base de chaque pic. L'axe des abscisses représente le temps de rétention, généralement mesuré en secondes. Ainsi, si un pic commence à 15,1 secondes et se termine à 18,5 secondes, sa largeur est (18,5 - 15,1) = 3,4 secondes.
Déterminer les temps de rétention en notant l'heure, c'est-à-dire l'emplacement sur le x- axe, qui correspond aux emplacements des maxima des pics. Cette valeur sera normalement à mi-chemin entre les deux valeurs utilisées pour calculer la largeur à l'étape 1. L'exemple donné à l'étape 1, par exemple, montrerait un maximum à environ 16,8 secondes.
Calculer la résolution, R , entre deux pics de
R = (RT1 - RT2) /[0.5 * (W1 + W2)], où
où RT1 et RT2 représentent les temps de rétention des pics 1 et 2, et W1 et W2 représentent les largeurs des pics pris à leurs bases. En continuant l'exemple des étapes 2 et 3, un pic présente un temps de rétention de 16,8 secondes et une largeur de 3,4 secondes. Si le deuxième pic présentait un temps de rétention de 21,4 secondes avec une largeur de 3,6 secondes, la résolution serait alors
R = (21,4 - 16,8) /[0,5 * (3,4 + 3,6)] = 4,6 /3,5. = 1.3.
