Images de fluorescence confocale de surfaces de verre recouvertes des colorants cyanine Alexa Fluor 647 (a) et CF660C (b) et de colorant carborhodamine ATTO647N (c) après excitation lumineuse à 568 nanomètres (nm). En excitant les colorants absorbant le rouge à 640 nm dans certaines zones (images négatives en haut à droite), les colorants y sont photoconvertis et il est possible d'écrire sur la surface des lettres qui ont été excitées à 568 nm et fluorescentes à environ 580 nm. Le colorant carborhodamine montre un photobleuissement plus efficace que les colorants cyanine. Crédit :Team Markus Sauer / Université de Würzburg
Les derniers développements en microscopie à fluorescence permettent d'imager des molécules individuelles dans des cellules ou des complexes moléculaires avec une résolution spatiale allant jusqu'à 20 nanomètres. Cependant, dans certaines circonstances, il se produit un effet qui fausse les résultats :la lumière laser utilisée peut provoquer la formation de molécules d'oxygène très réactives dans l'échantillon. Ceux-ci peuvent alors endommager les colorants fluorescents utilisés à un point tel qu'ils ne sont plus fluorescents. Parmi les experts en microscopie, cet effet est connu sous le nom de photoblanchiment.
Cependant, divers colorants fluorescents peuvent également être transformés par photoblanchiment afin qu'ils absorbent la lumière de longueurs d'onde plus courtes. "Un colorant fluorescent auparavant rouge brille alors en vert. Sa fluorescence a été décalée vers la gamme bleue sur l'échelle de longueur d'onde. C'est pourquoi cet effet est appelé photoblueing, " explique le professeur Markus Sauer, un expert en microscopie super-résolution du Biocentre de Julius-Maximilians-Universität Würzburg (JMU) en Bavière, Allemagne.
Première description exacte du photoblueing
L'équipe de Sauer présente maintenant le mécanisme moléculaire exact du photobleuissement pour les colorants cyanine comme Cy5 pour la première fois dans le journal Méthodes naturelles . Le Dr Martin Schnermann du Center for Cancer Research de Frederick (États-Unis) est également impliqué dans la publication.
"Parce que nous avons compris le mécanisme si précisément, nous avons pu empêcher le photobleuissement par de simples additifs comme la vitamine C ou l'augmenter en ajoutant une sorte de catalyseur, " dit Markus Sauer.
Prévenir le photoblueing peut être très important. Bien que l'effet ne puisse affecter que quelques pour cent du colorant utilisé, elle peut néanmoins conduire à des erreurs ou des interprétations erronées de la microscopie, par exemple dans les expériences de transfert d'énergie (FRET). En effet, les colorants convertis sont détectés avec la même sensibilité élevée que les produits de départ.
Les tampons simples empêchent le photoblueing
"Nos résultats montrent quels colorants sont affectés et comment le photobleuissement peut être évité par de simples ajouts de tampon, " Sauer dit, concernant le contenu de la Méthodes naturelles papier. "Mais ils montrent également comment le photoblueing peut éventuellement être utilisé de manière avantageuse pour l'imagerie de fluorescence et pour le suivi d'un seul, molécules de colorant spécifiquement converties."
C'est exactement ce que l'équipe de Sauer prévoit de s'attaquer ensuite :entre autres, le suivi ciblé de particules bactériennes et virales individuelles dans les processus d'infection. Le travail décrit ici a été financé par la Fondation allemande pour la recherche DFG.
