Présentation du système Miniscope3D. Par rapport aux modèles Miniscope et MiniLFM précédents, notre Miniscope3D est plus léger et plus compact. Nous retirons la lentille du tube du Miniscope et plaçons un masque de phase optimisé de 55 m d'épaisseur au diaphragme d'ouverture (plan de Fourier) de l'objectif GRIN. Un ensemble clairsemé (64 par profondeur) de fonctions d'étalement des points d'étalonnage (PSF) est capturé en scannant une perle fluorescente verte de 2,5 m dans tout le volume. Nous utilisons cet ensemble de données pour pré-calculer un modèle avancé efficace qui capture avec précision les aberrations variant sur le terrain. Le modèle direct est ensuite utilisé pour résoudre de manière itérative un problème inverse pour reconstruire des volumes 3D à partir de mesures 2D monocoup. La reconstruction 3D ici est celle d'un tardigrade nageant librement et marqué par fluorescence. Crédit :Lumière :Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Un microscope à fluorescence miniature qui pèse moins tout en offrant une résolution élevée par rapport aux appareils existants aura une gamme d'applications en biologie des systèmes. Les microscopes miniatures à fluorescence existants sont une technique standard dans les sciences de la vie, mais ils n'offrent que des informations bidimensionnelles (2-D). Dans un nouveau rapport maintenant sur Lumière de la nature :science et applications , Kyrollos Yanny, Nick Antipa et une équipe de scientifiques du Joint Graduate Program in Bioengineering, Génie électrique et informatique à l'Université de Californie, Berkeley et l'Université libre de Bruxelles Belgique, développé un microscope à fluorescence 3-D monocoup. Ils ont conçu le nouveau dispositif connu sous le nom de Miniscope3D en remplaçant la lentille tubulaire d'un miniscope 2D conventionnel par un masque de phase multifocal optimisé au niveau du diaphragme de l'objectif. À l'aide de l'appareil, Yanny et Antipa et al. activité neuronale enregistrée optiquement chez les animaux se déplaçant librement et dans les applications d'imagerie in situ à long terme dans les incubateurs et dans les dispositifs de laboratoire sur puce.
Imagerie de fluorescence miniature et innovations techniques
Les microscopes à fluorescence miniatures sont importants en biologie des systèmes pour les enregistrements optiques de l'activité neuronale chez les animaux se déplaçant librement, imagerie in situ à long terme en incubateurs et dispositifs médicaux. De tels microscopes sont également connus sous le nom de "miniscopes" et sont constitués de pièces imprimées en 3D, bien qu'offrant uniquement l'imagerie par fluorescence 2D. Les méthodes de prise de vue unique peuvent permettre des vitesses de capture plus rapides et une résolution temporelle limitée par la fréquence d'images de la caméra. Par exemple, un microscope miniature à champ lumineux (MiniLFM) développé précédemment peut traiter l'activité neuronale avec un algorithme optimisé. Dans ce travail, Yanny et al. développé un miniscope 3D pour obtenir une résolution plus élevée avec un poids plus léger par rapport aux techniques existantes. L'équipe a testé les capacités microscopiques en imageant des cibles de résolution fluorescentes ainsi qu'en nageant librement des échantillons biologiques et des tissus cérébraux de souris. Ils ont validé les résultats reconstruits par rapport à la microscopie à deux photons pour comprendre les limites de la nouvelle technique.
Fabrication de masques de phase avec nanoscribe. (a) La couture rectangulaire conduit à des coutures (lignes noires) passant par les nombreuses microlentilles, tandis que la couture adaptative place les coutures aux limites des microlentilles pour atténuer les artefacts. (b) Comparaison entre les PSF conçus et expérimentaux à quelques profondeurs d'échantillonnage, montrant un bon accord, avec une légère dégradation au bord du volume. Crédit :Lumière :Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Pour obtenir une imagerie de haute qualité dans un petit appareil léger, Yanny et al. placé le masque de phase (où la lumière passant à travers le masque subira un déphasage proportionnel à l'épaisseur du matériau) dans l'espace de Fourier pour réduire la charge de calcul et améliorer la compacité. Ils ont ajouté des capacités 3D au miniscope 2D au prix d'une petite perte de résolution latérale et d'un rapport signal/bruit inférieur. L'algorithme a uni la théorie optique à la détection compressée pour fabriquer les masques de phase optimisés. La technique a facilité une nouvelle architecture de microscope 3D miniature avec une résolution plus élevée, conceptions open source, une fabrication de meilleure qualité et un schéma d'étalonnage ou un algorithme de reconstruction efficace.
Caractériser le microscope informatique et étudier le cerveau de la souris
L'équipe a testé les performances du microscope informatique en utilisant des échantillons de complexité croissante pour capturer des enregistrements dynamiques en 3D. Ils ont mesuré la résolution latérale à différentes profondeurs en imageant une cible de résolution fluorescente. Ils ont ensuite validé l'exactitude de leurs résultats en utilisant la microscopie à deux photons. Par exemple, le Miniscope3D pourrait récupérer avec précision toutes les images reconstruites du post-traitement de l'échantillon de billes fluorescentes 3-D. Ils ont montré le potentiel de la méthode en utilisant des échantillons neurobiologiques où les régions marquées par des protéines fluorescentes vertes exprimaient des populations clairsemées de neurones dans tout l'échantillon. Les images reconstruites obtenues à partir de différentes parties de l'hippocampe montraient des dendrites traversant la surface le long des corps cellulaires individuels. Lorsque Yanny et al. ensuite étudié des échantillons dynamiques de nage libre, les tardigrades teints en vert (également appelés ours d'eau), les images reconstruites ont montré l'efficacité de l'imagerie Miniscope3D pour suivre les organismes biologiques en mouvement libre à haute résolution dans l'espace-temps.
Caractérisation expérimentale. (a) Reconstructions d'une cible fluorescente de l'USAF à différentes positions axiales pour déterminer la résolution latérale dépendante de la profondeur. Nous récupérons une résolution de 2,76 m sur la plupart des 390 m de profondeur, avec le pire des cas de 3,9 μm (les lignes oranges pointillées marquent les emplacements en médaillon, et les cases jaunes dans les encarts indiquent les plus petits groupes résolus). Notez que la cible de résolution a des niveaux de résolution discrets qui entraînent des sauts dans les données et que la résolution fait ici référence à l'écart entre les barres, pas la largeur de la paire de lignes. (b) Reconstruction d'un échantillon de 160 m d'épaisseur de billes fluorescentes de 4,8 m par rapport à une image à balayage 3D à deux photons (les projections d'intensité maximale dans les plans yx et zx sont affichées). Notre système détecte les mêmes caractéristiques, avec une taille de tache latérale légèrement plus grande. Crédit :Lumière :Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Reconstruction de neurones marqués GFP dans une tranche de cerveau de souris optiquement nettoyée de 300 µm d'épaisseur démontrant la résolution d'un seul neurone et des dendrites clairement résolues traversant le volume axialement. Crédit :Lumière :Science &Applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Reconstruction 3D de tardigrades nageant librement. (À gauche) Données brutes. (À droite) Reconstruction de tardigrades colorés en vert SYBR se déplaçant librement. Crédit :Crédit :Léger :Science et applications, doi:10.1038/s41377-020-00403-7
Applications et accessibilité de l'appareil
La plupart des applications du Miniscope3D seront similaires à la microscopie 3D et au MiniLFM (microscopie miniature à champ lumineux), qui est considéré comme l'étalon-or pour l'imagerie par fluorescence 3D miniature monocoup. Par rapport au MiniLFM, cependant, la nouvelle méthode Miniscope3D a offert de multiples améliorations, notamment des lentilles multifocales, meilleure résolution latérale du cas et une augmentation de 10 fois du volume de mesure utilisable. Les performances améliorées sont arrivées dans un package matériel plus petit que le MiniLFM avec un poids plus léger pour observer librement les organismes en mouvement. La méthode a en outre permis une reconstruction expérimentale avec ou sans diffusion pour le tissu cérébral de souris à une résolution de neurone unique. L'équipe optimisera les limites existantes de l'appareil, y compris la diffusion, pour d'autres applications.
En s'appuyant sur une plate-forme de miniscope open source populaire, Yanny et al. fourni l'accessibilité pour la conception Miniscope3D. De cette façon, Kyrollos Yanny, Nick Antipa et ses collègues ont fourni un prototype 3D comme une opportunité de mettre à niveau les miniscopes 2D actuellement utilisés dans 450 laboratoires. Les résultats expérimentaux étaient en bon accord avec la conception et l'analyse théoriques pour servir de cadre utile pour les systèmes 3-D à une seule prise personnalisés.
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