Les scientifiques de l'EPFL ont développé une imagerie super-résolution multicolore robuste et facile à mettre en œuvre. L'approche est basée sur l'acquisition simultanée de deux canaux spectraux suivie d'une analyse spectrale croisée et d'un démixage. Ils exploitent le clignotement des fluorophores et la diaphonie spectrale pour la génération de canaux de couleur supplémentaires avec des images super-résolues.

La microscopie à fluorescence multicolore est un outil important pour les sciences de la vie pour étudier les arrangements relatifs des structures cellulaires ou les interactions de différentes protéines. Cependant, microscopes conventionnels, les chevaux de bataille pour de nombreuses études biologiques, ne peut résoudre que des détails sur l'ordre de la longueur d'onde de la lumière. Au cours des deux dernières décennies, plusieurs concepts de microscopie à super-résolution ont aidé les chercheurs à dépasser cette limite de diffraction et à faire de nouvelles découvertes. Ces nouvelles méthodes ne trouvent que lentement leur place dans les applications biologiques de routine. Pour certaines des nouvelles techniques, cela est dû au matériel de microscope complexe, mais les exigences accrues en matière de préparation d'échantillons et d'étiquettes fluorescentes posent également des obstacles importants. Les exigences d'une imagerie super-résolution réussie sont encore plus difficiles à satisfaire pour les applications multicolores.

Le Laboratoire d'optique biomédicale de l'EPFL dirigé par Theo Lasser a beaucoup travaillé sur l'imagerie par fluctuation optique à super-résolution (SOFI) pour augmenter la résolution spatiale et l'échantillonnage en 2D et 3D. SOFI est une alternative aux techniques de microscopie de localisation de molécule unique telles que STORM et PALM. Il analyse les statistiques spatio-temporelles d'ordre supérieur d'une série chronologique de fluorophores clignotants et ne nécessite pas l'isolement des émissions de fluorophores individuels. SOFI est compatible avec une plus large gamme de conditions d'étiquetage et d'imagerie, ce qui simplifie la sélection des fluorophores et les expériences. Dans leur nouvelle étude, des chercheurs de l'École d'ingénieurs dirigés par Theo Lasser et Aleksandra Radenovic (responsable du Laboratoire de biologie à l'échelle nanométrique) ont étendu l'analyse statistique au domaine spectral pour ouvrir la voie à une nouvelle approche pour l'imagerie multicolore à super-résolution.

Le nombre de couleurs n'est pas limité par les canaux spectraux du microscope ou par l'exploitation de la diaphonie spectrale

L'idée derrière l'approche SOFI multicolore est la suivante. En imagerie multicolore classique, la diaphonie entre les différents canaux spectraux du microscope doit être évitée. Ici, les chercheurs exploitent la diaphonie pour générer des canaux de couleur supplémentaires. Ils appliquent une analyse de cumul croisé entre plusieurs canaux spectraux acquis simultanément. L'analyse statistique leur permet de compléter les canaux de détection physiques fournis par le microscope par des canaux spectraux virtuels supplémentaires. "Seuls les signaux qui sont spatialement et temporellement corrélés dans les différents canaux spectraux apparaîtront dans les canaux virtuels. Nous captons exactement la diaphonie dont tout le monde veut se débarrasser." explique Kristin Grußmayer, l'un des principaux auteurs de l'étude. Les canaux spectraux supplémentaires générés par calcul ainsi que le démixage linéaire permettent l'imagerie de couleurs de fluorophore plus distinctes que les canaux de détection physiques enregistrés.

La publication fournit la théorie derrière le SOFI multicolore à cumul croisé spectral et comprend un cadre pour optimiser les canaux spectraux du microscope pour une combinaison donnée de fluorophores qui doivent être imagés. Les jeux de données simulés ont aidé l'équipe à vérifier que leur nouvelle approche multicolore devrait fonctionner pour un large éventail d'étiquettes avec différentes propriétés photophysiques, même pour ceux dont les spectres d'émission se chevauchent fortement. « Nous pourrions montrer que notre approche fonctionne pour l'imagerie en trois couleurs dans des cellules fixes et vivantes pour une variété de colorants et de protéines fluorescentes. L'imagerie peut être réalisée à l'aide d'installations commerciales à grand champ avec des unités de division d'image à deux canaux qui sont largement disponibles. En principe. , nous ne sommes pas limités à 3 couleurs." déclare Kristin Grußmayer.

Les instructions pour effectuer l'analyse SOFI spectrale multicolor à cumul croisé sont disponibles sur la page Web du Laboratoire de biologie à l'échelle nanométrique sous www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ et le progiciel peut être téléchargé sur www.epfl.ch/ labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip .