Figure 1 :Le système optique du microscope holographique numérique. Crédit :Université de Kobe
Un groupe de recherche dirigé par le professeur MATOBA Osamu (Organisation pour la recherche avancée et intégrée) de l'Université de Kobe a réussi à créer une imagerie de fluorescence et de phase en 3D de cellules vivantes basée sur l'holographie numérique. Ils ont utilisé des cellules végétales avec des marqueurs protéiques fluorescents dans leurs noyaux pour démontrer ce système d'imagerie.
Le groupe était composé du professeur adjoint de projet Manoj KUMAR et du professeur adjoint Xiangyu QUAN (tous deux de la Graduate School of System Informatics), Professeur AWATSUJI Yasuhiro (Kyoto Institute of Technology) et Professeur agrégé TAMADA Yosuke (Université d'Utsunomiya).
Cette technologie constituera une base pour l'imagerie des cellules vivantes, indispensable dans le domaine des sciences de la vie. On s'attend également à ce que l'utilisation de cette technologie pour visualiser les processus des cellules souches dans les plantes augmente notre compréhension de ceux-ci.
Ces résultats de recherche ont été publiés dans la revue Rapports scientifiques , publié par Springer Nature le 15 mai.
Fond de recherche
Le microscope optique a été inventé à la fin du XVIe siècle et le scientifique britannique Robert Hooke a été le premier à découvrir des cellules au milieu du XVIIe siècle. L'invention a été développée dans de nouvelles technologies telles que le microscope à contraste de phase (prix Nobel de physique de 1953), qui permet d'observer les cellules vivantes sans avoir besoin de les colorer, et imagerie cellulaire fluorescente, dans lequel des molécules spécifiques sont marquées à l'aide de protéines fluorescentes (prix Nobel de chimie 2008) et observées dans des cellules vivantes. Ceux-ci sont devenus des outils d'observation incontournables dans les domaines des sciences de la vie et de la médecine.
Figure 2 :Résultats d'imagerie de fluorescence 3D pour Physcomitrella patens. Ci-dessous :Les flèches jaunes indiquent des images fluorescentes de noyaux au foyer. Crédit :Université de Kobe
L'imagerie de phase utilise la différence de longueur optique de la lumière lorsqu'elle traverse un échantillon biologique pour révéler des informations structurelles à son sujet. L'imagerie par fluorescence fournit des informations sur des molécules spécifiques à l'intérieur de l'échantillon biologique, et peuvent révéler leurs fonctions. Cependant, la structure intracellulaire et la motilité sont complexes. La capacité de visualiser des informations physiques multidimensionnelles comprenant l'imagerie de phase et de fluorescence serait utile pour comprendre ces aspects. Un système d'imagerie capable de générer simultanément et instantanément des informations physiques variées à partir de cellules vivantes en 3D servirait de technologie de base pour innover en biologie.
Le système d'imagerie multimodal hybride construit dans cette étude peut obtenir des informations 3-D de phase et fluorescentes en un seul coup. Il permet aux chercheurs de visualiser quantitativement et simultanément les informations structurelles ou fonctionnelles d'un échantillon biologique à l'aide d'une seule plateforme.
Méthodologie de recherche
Dans cette étude, les chercheurs ont construit un microscope holographique numérique multimodal capable d'enregistrer simultanément les informations de fluorescence et de phase d'un échantillon (Figure 1). Celui-ci utilise l'holographie numérique comme base, moyennant quoi des informations de lumière interférée provenant de l'objet sont enregistrées, puis des calculs optiques effectués par ordinateur sont utilisés pour générer des informations spatiales en 3D sur l'objet.
Le microscope de l'étude est composé de deux systèmes optiques différents. Premièrement, le système d'imagerie holographique à fluorescence 3-D, comme indiqué sur le côté droit de la figure 1. Afin d'obtenir les informations de fluorescence 3-D, un modulateur spatial de lumière est utilisé pour diviser la lumière fluorescente émise par les molécules fluorescentes en deux ondes lumineuses qui peuvent interférer l'une avec l'autre.
À ce point, les informations 3-D de la lumière de l'objet sont préservées en donnant à l'une des ondes lumineuses un rayon de courbure et une direction de propagation légèrement différents ; à la fois, les deux ondes lumineuses sont sur un chemin optique commun (procédant majoritairement selon le même axe) permettant une mesure d'interférence temporellement stable. Ce système optique a été formulé dans cette étude, clarifier pour la première fois la distribution d'intensité d'interférence enregistrée. Cette formule a permis aux chercheurs de trouver des conditions expérimentales qui amélioreraient la qualité des images fluorescentes reconstruites. Ils ont pu générer des images tridimensionnelles de cellules vivantes et de leurs structures en appliquant ce système holographique 3D fluorescent. Les molécules et les structures des cellules vivantes ont été marquées avec des protéines fluorescentes, permettant d'observer leurs comportements dynamiques grâce à cette nouvelle microscopie à fluorescence 3D.
Figure 3 :Résultats d'imagerie de phase 3-D pour Physcomitrella patens et les images de phase reconstruites à partir de différents plans reconstruits. A droite, la carte en 3D.
La technologie d'imagerie développée par cette étude permet des images 3D, qui, jusqu'à présent, prenaient relativement plus de temps à générer par balayage laser, à générer en une seule prise de vue sans avoir besoin de numériser.
Prochain, comme illustré à gauche de la figure 1, est le système d'imagerie holographique en phase 3-D. Une cellule végétale vivante est constituée de composants tels qu'un noyau, mitochondries, chloroplastes, et une paroi cellulaire mince. Il est possible de visualiser les structures de ces composants à partir des différences de phase (longueur du chemin optique). Dans ce système, l'adoption de l'interféromètre de Mach-Zehnder permet d'utiliser l'onde plane de référence, permettant d'obtenir facilement la frange d'interférence optimale pour chaque objet mesuré.
Ce microscope holographique numérique a été créé en unifiant les systèmes de mesure de fluorescence et de phase.
Ensuite, ce microscope a été utilisé pour visualiser des cellules végétales vivantes. Une expérience a été menée pour prouver qu'il est possible d'effectuer des observations en 4D en appliquant une 3D spatiale et un axe de temps (unidimensionnel). La mousse Physcomitrella patens et des billes fluorescentes d'une taille moyenne de 10 µm ont été utilisées. Les figures 2 et 3 montrent les résultats de l'expérience pour la fluorescence 3D simultanée et l'imagerie de phase de la mousse. La figure 2 (b) montre que sept noyaux sont visibles lorsqu'un microscope à fluorescence plein champ conventionnel est utilisé. De ces sept, les noyaux numérotés 1, 2, et 4 sont au point, cependant, ce n'est pas le cas pour les noyaux dans des endroits à différentes profondeurs car il s'agit d'une image fluorescente faible avec un flou généralisé. Dans la méthodologie proposée par cette étude pour résoudre ce problème, les informations sur les ondes lumineuses fluorescentes ont été extraites de l'hologramme fluorescent de la figure 2 (c). Sur la base de ces informations, l'algorithme de propagation numérique de Fresnel permet d'obtenir des images fluorescentes reconstruites à n'importe quelle profondeur ou distance. Par conséquent, des images nettes de plusieurs noyaux fluorescents à différentes profondeurs ont été restaurées à partir d'une seule image sans balayage.
Figure 2 (d), (e), et (f) montrer les images reconstruites dans trois plans différents. La distance axiale entre (d) et (e) est de 10 micromètres, et 15 micromètres entre (e) et (f). Les flèches jaunes indiquent les noyaux mis au point. Il est possible de voir lequel des sept noyaux de l'image de fluorescence est focalisé dans les trois plans.
La figure 3 montre la distribution de phase quantitative pour les trois plans à différentes profondeurs. Il a été possible de visualiser des chloroplastes individuels (il y en a beaucoup sur les bords des cellules, comme indiqué par les pics rouges sur la figure 3 (b)). L'épaisseur de la cellule, tel que calculé à partir des valeurs de phase quantitatives mesurées, était d'environ 17 micromètres, une taille très proche des autres valeurs de référence.
Figure 4 :Billes fluorescentes flottant dans une solution. Crédit :Université de Kobe
Dans la figure 4, vous pouvez voir des billes fluorescentes (d'environ 10 micromètres) flotter dans une solution. Les informations de phase et de fluorescence ont été générées à partir d'enregistrements à l'aide de la méthodologie proposée. Les billes se déplacent également dans le sens de la profondeur, il est donc possible de récupérer leur position 3D en modifiant la distance de reconstruction pour qu'elles restent nettes.
Dans cette étude, un microscope holographique numérique multimodal a été développé, capable de mesures simultanées de phase et de fluorescence en 3D. Avec la possibilité d'effectuer une imagerie de phase quantitative et de fluorescence en même temps, on pense que cette méthode servira de nouvelle technologie de base pour la visualisation des tissus et cellules biologiques vivants. En particulier, il a été démontré que ce microscope peut être appliqué à des cellules végétales complexes. Il pourrait être utilisé pour acquérir une compréhension diversifiée du processus de formation des cellules souches chez les plantes, qui se reproduisent plus facilement que les cellules animales. À l'avenir, il peut être possible d'utiliser ces informations pour contrôler le processus des cellules souches via une stimulation par la lumière. La reproduction et la croissance efficaces des plantes obtenues grâce à l'imagerie proposée et à la stimulation future pourraient être appliquées au développement d'un système de culture alimentaire.
Cette technologie pourrait être développée en améliorant encore l'efficacité d'utilisation de la lumière. En holographie numérique, il est nécessaire d'élargir spatialement le diamètre du faisceau, le diviser en deux, puis les superposer à nouveau afin d'utiliser l'interférence entre les deux chemins de lumière. Par conséquent, il faut aussi augmenter l'énergie de fluorescence pour qu'elle soit observée par le capteur d'images. Pour y parvenir, une grande quantité d'énergie lumineuse serait nécessaire pour éclairer les cellules vivantes, cependant, les dommages cellulaires causés par la lumière seraient un gros problème. On pense qu'un hologramme de volume pourrait être utilisé pour augmenter l'efficacité d'utilisation de la lumière tout en évitant la phototoxicité cellulaire.
Un autre problème est que la distribution 3D reconstruite s'étend dans la direction de propagation de la lumière (la direction de la profondeur de l'objet), résolution axiale décroissante. Les chercheurs travaillent sur des méthodes utilisant l'apprentissage en profondeur et le filtrage afin de supprimer cette extension en profondeur et d'améliorer la qualité de l'image.
