Représentation schématique du système de microscopie hybride contenant un sous-système de microscopie optoacoustique à double longueur d'onde à 488 nm et 808 nm, co-aligné avec un sous-système pour la microscopie multiphotonique à 1043 nm. a) Amplificateur AMP, Caméra CCD à fond clair, Carte d'acquisition de données DAQ, Miroir dichroïque DM, Contrôleur de miroir galvanométrique GC, démodulateur IQD IQ, LO1 oscillateur local 1, LO2 oscillateur local 2, Filtres à densité neutre NDF, Optoacoustique OA, DE filtre optique, ordinateur personnel PC, trou d'épingle PH, Tube photomultiplicateur PMT, Génération de deuxième harmonique SHG, THG troisième génération harmonique, Fluorescence d'excitation à deux photons TPEF, platines motorisées xyz. b) Le spectre des longueurs d'onde d'excitation et de détection en imagerie hybride FDOM/multiphoton (MP). c) Comparaison schématique entre la microscopie optoacoustique dans le domaine temporel (TD), qui utilise de courtes impulsions lumineuses, et la microscopie optoacoustique dans le domaine fréquentiel (FD), qui est basé sur l'intensité laser modulée à plusieurs fréquences discrètes. Crédit: Lumière :science et applications . Doi :https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
L'imagerie optoacoustique alimentée par de courtes rafales de lasers à ondes continues (CW) peut stimuler l'émission d'ondes ultrasonores à l'intérieur d'un animal ou chez des sujets humains. La méthode peut capturer de manière non invasive le flux sanguin et produire des images 3D de la microarchitecture cellulaire. Écrire dans Lumière :science et applications , Stephan Kellnberger et ses collègues de l'Institut d'imagerie biologique et médicale, rapportent maintenant la possibilité d'obtenir des images optoacoustiques de haute fidélité avec des lasers rentables contrôlés à plusieurs fréquences.
Les auteurs ont démontré expérimentalement la fréquence multiple, génération d'images haute fidélité de l'architecture biologique par imagerie de la microvascularisation des tissus des poissons et des souris. Dans les expériences d'imagerie, ils ont superposé des détails structurels qui n'apparaissaient qu'à des fréquences d'intérêt spécifiques. Les auteurs ont également identifié de manière non invasive la vitesse du flux sanguin dans la microvascularisation des tissus en suivant les décalages de fréquence à l'aide de l'effet Doppler optoacoustique.
La détection optoacoustique (photoacoustique) nécessite généralement des technologies laser complexes. De telles techniques peuvent générer une longueur de nanoseconde (1-100 ns), des impulsions photoniques courtes à haute énergie qui illuminent de manière conventionnelle une énergie transitoire (de courte durée) dans le domaine temporel (TD). Les impulsions ultra-courtes peuvent stimuler l'émission d'ondes ultrasonores à large bande, collectées dans la plage de la microseconde pour former des images optoacoustiques. Cependant, la technologie laser complexe peut imposer une fréquence de répétition d'impulsions faible (PRF) et limiter le nombre de longueurs d'onde simultanément disponibles pour l'imagerie spectrale. Pour éviter de telles limites, Kellnberger et al. développé la microscopie optoacoustique dans le domaine fréquentiel (FDOM), dans lequel l'intensité lumineuse peut être contrôlée ou modulée à plusieurs fréquences discrètes à l'aide d'un matériel économique.
Explication du codage de fréquence en FDOM à double longueur d'onde. a) Schéma simplifié du codage de fréquence sur différentes longueurs d'onde. La source laser 1 émettant à λ1 =488 nm a été chargée avec la fréquence de modulation la plus basse f1, tandis que la source laser 2 émettant à 2 =808 nm était chargée avec la fréquence de modulation la plus élevée fend. Pendant l'imagerie, nous avons augmenté la modulation de la longueur d'onde 1 et diminué la fréquence de modulation de λ2 par pas de fstep en utilisant des nombres impairs de fréquences de modulation. b) Représentation schématique des fréquences de modulation multiples utilisées pour l'imagerie, montrant la superposition de fréquences à deux longueurs d'onde. Crédit: Lumière :science et applications . Doi :https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Jusqu'ici, l'imagerie optoacoustique s'est appuyée uniquement sur des techniques qui détectent les signaux dans le domaine temporel (TD) ou celles qui ne balayent qu'une seule fréquence à une ou deux longueurs d'onde dans le domaine fréquentiel (FD). La présente étude était une première à mener une imagerie optoacoustique in vivo dans un modèle animal via un éclairage simultané avec deux longueurs d'onde.
Les scientifiques ont combiné FDOM dans un système hybride pour examiner la relation entre la formation d'images et le contrôle de la fréquence. L'utilisation de fréquences discrètes (un maximum de neuf), a permis des mesures de décalage Doppler optoacoustiques non invasives en tant qu'observations de flux dans une chambre à flux microfluidique en laboratoire d'abord, et dans la microvascularisation tissulaire in vivo par la suite. Dans l'étude, Kellnberger et al. utilisé deux lasers à diodes CW émettant de la lumière à 488 nm et 808 nm pour l'éclairage.
Les scientifiques ont mis en œuvre le FDOM, fonctionnant dans la gamme de fréquences de 5-50 MHz, en tant que système hybride avec microscopie multiphotonique (MP) fonctionnant à 1043 nm. Ils ont ensuite réalisé une imagerie bidimensionnelle/tridimensionnelle basée sur des mesures d'amplitude et de phase ultrasonores à plusieurs fréquences. L'amplitude et la phase des signaux optoacoustiques générés ont été résolus par démodulation en temps réel et enregistrés à l'aide d'un convertisseur analogique-numérique. En raison des taux de redoublement élevés, le FDOM a atteint des rapports signal sur bruit (SNR) élevés, conduisant aux images haute-fidélité observées. Au total, l'étude a examiné la relation entre la fréquence de modulation, la fidélité de l'image et le rapport signal sur bruit (SNR).
Imagerie FDOM à longueur d'onde unique d'une suture et d'échantillons de poisson zèbre ex vivo. a) Une illustration schématique du balayage de deux sutures croisées. b) Images FDOM codées par couleur de deux sutures de 50 µm, basé sur un éclairage à 488 nm et des fréquences de modulation de 10, 20, 30, et 40 MHz. La représentation couleur espace-fréquence (FSR) superpose les contributions de chaque fréquence de modulation. L'image FSR en niveaux de gris basée sur quatre fréquences montre l'image finale. c) Profil en coupe transversale de la ligne pointillée montrée dans le panneau b, qui compare les contrastes révélés par les différentes fréquences de modulation. d) Imagerie ex vivo d'un globe oculaire de larve de poisson zèbre. L'image violette a été reconstruite en utilisant des fréquences basses (L) (10, 15, et 20 MHz); l'image verte utilisant les fréquences moyennes (M) (25, 30, et 35 MHz); et l'image rouge utilisant des fréquences élevées (H) (40, 45, et 50 MHz). La superposition codée par couleur de toutes les fréquences (FSR, 10 à 50 MHz) met en évidence la contribution de chaque région spectrale. e) La couleur orange représente la somme des amplitudes pour les neuf fréquences de modulation utilisées. f) Une image en fond clair d'un œil de poisson zèbre, valider la fidélité des images FDOM. g) Une comparaison des rapports signal sur bruit (SNR) d'images de deux sutures croisées (diamètre 40 µm) obtenues par microscopie optoacoustique FD et TD. L'image FDOM a donné un SNR de ~35 dB. h) Dans des conditions expérimentales similaires, La microscopie TD a donné un SNR d'environ 29 dB. Crédit: Lumière :science et applications . Doi :https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Pour identifier les caractéristiques de l'imagerie photoacoustique FD, les scientifiques ont imagé une paire de sutures croisées dans l'eau à deux longueurs d'onde (488 nm et 808 nm) et à des fréquences de modulation discrètes. La superposition de diverses contributions de fréquence a porté l'information de l'objet imagé (sutures).
Pour extraire des informations de structures plus complexes, Kellnberger et al. a imagé l'œil de la lave de poisson zèbre de type sauvage de 5 jours ex vivo, en utilisant neuf fréquences de modulation couvrant 10-50 MHz par pas de 5 MHz. Les scientifiques ont également comparé le SNR (rapport signal sur bruit) entre la méthode FDOM et le TD conventionnel, qui variaient selon les paramètres expérimentaux (énergie laser, puissance utilisée et matériel d'acquisition de données).
Les données d'amplitude et de phase multifréquences pourraient ainsi être traitées pour la reconstruction d'images 3D à l'aide d'une transformée de Fourier basée sur la représentation fréquence-espace (FSR) et la représentation temps-espace (TSR). Par rapport à la TSR, la reconstruction d'image basée sur FSR était plus rapide du point de vue informatique et ne nécessitait pas d'inversion des données pendant la reconstruction d'image.
Imagerie FDOM simple et double longueur d'onde d'une oreille de souris in vivo. a) Imagerie FDOM à 488 nm. La couleur cyan représente l'image reconstruite, à partir de neuf fréquences également espacées dans la gamme de 10 à 50 MHz. b–d) Images individuelles obtenues à des fréquences de modulation de 10, 30, et 50 MHz, qui représentent les structures dans la boîte en pointillés dans le panneau a. e) SNR en fonction de n fréquences qui ont été utilisées pour la reconstruction FSR. Une amélioration asymptotique est observée pour n > 8 fréquences discrètes. f) Une vue de profil de la boîte en pointillés dans le panneau a, qui est délimité par une flèche pointillée blanche. Il démontre la relation entre la fréquence de modulation et la résolution d'imagerie. Les croix jaunes mettent en évidence la résolution de l'imagerie en fonction de la fréquence de modulation :une modulation plus rapide (50 MHz) permet de résoudre clairement les petites structures, même jusqu'à 4 µm, alors qu'une modulation plus lente (10 MHz) ne le peut pas. g–l) Imagerie hybride FDOM/multiphoton d'une oreille de souris après injection de cellules de mélanome. g) Une image superposée qui a été obtenue à l'aide de quatre modalités de microscopie sans marquage :FDOM à 488 nm et 808 nm, SHG à 522 nm, et THG à 348 nm. h) Une image en fond clair validant les résultats obtenus par microscopie hybride; MC, cellules de mélanome. i) Imagerie FDOM à 488 nm montrant les cellules vasculaires et de mélanome. j) Une image FDOM à 808 nm qui montre des cellules de mélanome B16F10 injectées dans l'oreille de souris. k) Une image SHG montrant la distribution du collagène dans l'épiderme. l) Une image THG qui montre la morphologie du tissu ; principalement les kératinocytes et les follicules pileux. Crédit: Lumière :science et applications . Doi :https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2
Pour l'imagerie tissulaire in vivo basée sur FDOM, les scientifiques ont observé l'oreille d'une souris anesthésiée. Ils ont obtenu des images sans artefact avec de multiples fréquences de modulation correspondant aux fréquences spatiales de l'objet imagé. Les scientifiques ont utilisé un maximum de neuf fréquences dans l'étude. Le SNR de l'image est passé d'environ 14 dB à une seule fréquence à environ 30 dB à neuf fréquences pour des images plus nettes.
Ils ont ensuite observé une oreille de souris contenant des cellules de mélanome métastatique murin in vivo comme auparavant via une excitation synchronisée de deux longueurs d'onde (488 nm et 808 nm) à des fréquences de modulation distinctes. En utilisant la microscopie optoacoustique et optique combinée, Kellnberger et ses collègues ont réussi à imager efficacement les caractéristiques des tissus (c'est-à-dire le système vasculaire, cellules de mélanome, collagène et kératinocytes) sans marqueurs ou marqueurs fluorescents conventionnels.
Kellnberger et al. puis effectué des mesures FD micro-Doppler (µDoppler) avec la configuration pour la première fois dans une oreille de souris pour l'imagerie optoacoustique du flux sanguin microcirculatoire in vivo. Avant d'effectuer les mesures prévues, les scientifiques ont utilisé des particules de carbone noir à différents débits de circulation dans une puce microfluidique pour valider le dispositif expérimental. Le µDoppler FDOM a ensuite été utilisé pour générer une carte de la microcirculation dans une oreille de souris. Le flux sanguin microcirculatoire a révélé une augmentation progressive de la vitesse du bord du vaisseau vers le noyau.
Imagerie optoacoustique du flux sanguin microcirculatoire dans une oreille de souris in vivo. a Un schéma du montage de détection µDoppler. FL1− débit 1 éloigné du capteur US, FL2− débit 2 éloigné du capteur US (FL2− < FL1−), FL1+ débit 1 vers la sonde US, DANS le sens du flux dans la puce, Puce microfluidique MC, objectif OL, particules P, échographie américaine, transducteur à ultrasons UT, fréquence de modulation fmod, SORTIE direction du flux hors de la puce. Les vues rapprochées illustrent la détection expérimentale de particules s'éloignant du capteur à ultrasons, ce qui équivaut à un décalage vers le rouge Doppler. b-d Spectres de fréquence moyennés acquis à des vitesses d'écoulement de 0 mm·s−1 (vert), 0.3 mm·s−1 (rouge), ou 1,3 mm·s−1 (rouge). Les deux dernières vitesses d'écoulement présentent des décalages vers le rouge respectifs de 2 Hz et 7 Hz par rapport à la fréquence de modulation car les particules s'éloignent du transducteur. e Déplacements Doppler mesurés à partir de particules de carbone en fonction de la vitesse d'écoulement dans une puce microfluidique. La ligne noire montre un ajustement linéaire aux données. f Une projection d'intensité maximale d'une région d'intérêt (ROI) de taille 160 × 160 µm² dans l'oreille de la souris, qui montre une micro-vascularisation. Barre d'échelle, 30 µm. g Une carte de flux Doppler FDOM qui a été enregistrée dans le même ROI, montrant une amplitude maximale du débit enregistré dans les vaisseaux sanguins. h, i Un mélange et une superposition de la carte de flux Doppler g et de l'image optoacoustique f, qui montrent les amplitudes maximales sous forme de décalage Doppler rouge et bleu par rapport à la position du transducteur. j Une superposition de cartes Doppler de décalage rouge et bleu sur le balayage galvanométrique dans le panneau f. Les flèches blanches indiquent les directions déduites du flux sanguin dans divers vaisseaux. k Un balayage de profil à travers un seul capillaire à la position indiquée par les flèches blanches dans le balayage galvanométrique du panneau g. La ligne rouge représente un ajustement parabolique aux données de décalage Doppler enregistrées avec une vitesse de flux sanguin maximale de 0,44 mm·s-1. La courbe grise pleine montre les amplitudes de pic à chaque position de mesure. Crédit: Lumière :science et applications . Doi :https://doi.org/10.1038/s41377-018-0101-2.
De cette façon, l'étude a démontré pour la première fois l'utilisation de la détection et de la démodulation de signaux par microscopie optoacoustique dans le domaine fréquentiel (FDOM). Les scientifiques ont capturé des signaux d'amplitude et de phase à plusieurs fréquences de l'objet imagé. Le dispositif expérimental collectif contenait des sources lumineuses peu coûteuses, éclairage multi-longueurs d'onde simultanées et mesures de débit directes basées sur Doppler. Dans les études futures, Kellnberger et al. va quantifier les fréquences de modulation, la profondeur d'imagerie et augmenter la résolution de l'image en utilisant une configuration expérimentale améliorée.
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