Une technique récemment développée connue sous le nom de microscopie à fluorescence en nappe lumineuse a conduit à de nombreuses découvertes biologiques en permettant aux chercheurs de créer des images 3D de tissus, même des embryons d'animaux vivants, à l'aide de balises fluorescentes. Maintenant, les chercheurs rapportent la capacité d'augmenter la profondeur d'imagerie de la microscopie à fluorescence à couche lumineuse grâce à l'utilisation d'un phénomène optique connu sous le nom d'absorption à trois photons.

Dans la revue The Optical Society (OSA) Lettres d'optique , les chercheurs rapportent en détail comment l'absorption à trois photons peut être utilisée avec la microscopie à fluorescence à couche lumineuse pour imager plus profondément dans les tissus. A titre de démonstration, ils ont utilisé la technique combinée pour produire des images claires dans une boule de cellules en culture, connu sous le nom de sphéroïde, environ 450 microns de diamètre.

"Cette démonstration est très importante car elle répond à un besoin non satisfait d'une meilleure imagerie en profondeur, qui pourrait aider les scientifiques à obtenir de meilleures données sur les processus biologiques, " a déclaré le chef de l'équipe de recherche, Kishan Dholakia de l'Université de St. Andrews au Royaume-Uni. "Cette approche pourrait être particulièrement utile pour les études de neurosciences et de biologie du développement et pourrait trouver une application dans l'imagerie de plusieurs échantillons de manière automatisée pour la découverte de médicaments."

La lumière nécessaire pour imager les étiquettes fluorescentes peut être dommageable et même mortelle pour des échantillons biologiques délicats tels que des tissus cérébraux ou des embryons animaux utilisés pour étudier le développement et les processus pathologiques. La microscopie à fluorescence à feuille de lumière permet imagerie haute résolution avec peu de dommages optiques car elle éclaire un échantillon avec juste une fine feuille de lumière ; les autres parties de l'échantillon ne sont pas exposées inutilement à la lumière.

"Nous nous attendons à ce que la microscopie à fluorescence à feuille de lumière à trois photons ait un impact important sur l'imagerie du cerveau chez les rongeurs tels que les souris et les rats, où il pourrait être utilisé pour capturer des images à très grand champ avec une résolution subcellulaire, " a déclaré le premier auteur de l'article, Adrià Escobet-Montalbán.

Imagerie plus profonde

Les chercheurs ont voulu comparer la microscopie de fluorescence à feuille de lumière à trois photons à l'absorption à deux photons précédemment utilisée. En absorption multiphotonique, le marqueur fluorescent émet de la lumière après absorption, ou être excité par, deux ou trois photons plutôt que le photon utilisé pour produire la fluorescence traditionnelle.

L'absorption multiphotonique réduit la lumière floue et minimise la lumière qui pourrait nuire à l'échantillon car elle utilise des longueurs d'onde plus longues, qui sont moins dispersés par les tissus, et en confinant la lumière d'excitation à un petit volume. Lorsque trois photons sont utilisés pour produire de la fluorescence plutôt que deux, ces avantages sont amplifiés.

Pour démontrer leur nouvelle technique, les chercheurs ont utilisé une configuration optique standard pour la microscopie à fluorescence à couche lumineuse avec un laser pulsé qui est traditionnellement utilisé pour l'excitation à deux photons. Bien que ce laser n'était pas le plus approprié pour créer une excitation efficace à trois photons, il était idéal pour comparer l'excitation à deux photons et à trois photons.

L'équipe de recherche a imagé des sphéroïdes de cellules rénales embryonnaires humaines en utilisant une excitation à deux et trois photons. Près de la surface du sphéroïde, les deux modalités d'imagerie ont fonctionné de manière similaire. Cependant, de l'autre côté du sphéroïde, la qualité de l'image pour la microscopie à fluorescence à feuille de lumière à trois photons a conservé le contraste de l'image tandis que la qualité de l'image à deux photons a considérablement diminué.

Optimiser la technique

Pour améliorer encore l'imagerie en profondeur et le champ de vision, les chercheurs ont expérimenté le changement du profil d'intensité lumineuse du laser en un faisceau de Bessel, qui a un noyau central brillant entouré d'anneaux concentriques, plutôt que le faisceau laser gaussien solide traditionnel comme celui d'un pointeur laser.

« Les faisceaux de Bessel peuvent être utilisés en mode feuille de lumière à deux photons, mais peuvent produire des artefacts potentiels en raison de leurs anneaux concentriques, " a déclaré le co-auteur Federico Gasparoli. " Pour la première fois, nous montrons numériquement et expérimentalement que ces problèmes sont supprimés en microscopie à fluorescence à trois photons et que le faisceau va encore plus loin, rendant cette approche très attrayante.

Prochain, les chercheurs prévoient d'améliorer la technique en utilisant des systèmes laser à des longueurs d'onde plus longues spécialement conçus pour l'absorption à trois photons. Cela devrait permettre l'imagerie à une profondeur accrue. En parallèle, les chercheurs travaillent à développer des moyens de détecter la lumière émise par les marqueurs fluorescents profondément à l'intérieur des échantillons.