Lyse cellulaire :
- La procédure de lyse commence généralement par la remise en suspension des cellules bactériennes dans un tampon contenant du NaOH. Ce tampon crée un environnement alcalin avec un pH élevé, généralement autour de 12 à 12,8.
- A ce pH élevé, les membranes cellulaires et les parois cellulaires des bactéries sont perturbées, conduisant à la lyse cellulaire. Les composants cellulaires, dont l'ADN plasmidique, sont libérés dans le lysat.
Dénaturation de l'ADN chromosomique :
- L'environnement au pH élevé créé par NaOH cible et dénature spécifiquement l'ADN chromosomique des bactéries. L’ADN chromosomique est généralement volumineux et complexe, constitué d’une seule molécule circulaire.
- Les conditions fortement alcalines provoquent la rupture des liaisons hydrogène entre les brins d'ADN complémentaires, entraînant la dénaturation et la fragmentation de l'ADN chromosomique. Cette dénaturation perturbe effectivement l’intégrité structurelle de l’ADN chromosomique, le rendant non fonctionnel.
Préservation de l'ADN plasmidique :
- Contrairement à l'ADN chromosomique, l'ADN plasmidique est plus résistant à la dénaturation par NaOH. Les molécules plasmidiques sont généralement petites, circulaires et double brin, avec une structure super-enroulée qui améliore leur stabilité.
- La conformation superenroulée de l'ADN plasmidique lui permet de mieux résister aux conditions alcalines que l'ADN chromosomique. Par conséquent, même si l’ADN chromosomique est dénaturé, l’ADN plasmidique reste intact et conserve sa structure circulaire fermée de manière covalente.
Neutralisation :
- Après l'étape de lyse, le lysat contenant l'ADN chromosomique dénaturé et l'ADN plasmidique intact est neutralisé à l'aide d'un tampon contenant un agent neutralisant, tel que du Tris-HCl ou du tampon acétate.
- La neutralisation ramène le pH du lysat dans une plage physiologique, typiquement autour de pH 7-8. Cette étape est essentielle pour stopper le processus de dénaturation et assurer la stabilité de l’ADN plasmidique.
Isolement de l'ADN plasmidique :
- Après neutralisation, le lysat peut être traité davantage pour isoler l'ADN plasmidique. Cela peut impliquer des étapes supplémentaires telles que des techniques de centrifugation, de purification et de séparation basées sur la taille pour séparer l’ADN plasmidique des autres composants cellulaires.
En dénaturant sélectivement l'ADN chromosomique tout en préservant l'intégrité de l'ADN plasmidique, NaOH joue un rôle essentiel dans la procédure de lyse, permettant l'isolement efficace de molécules plasmidiques fermées de manière covalente pour diverses applications en aval, notamment le séquençage de l'ADN, le clonage et les expériences de génie génétique.
