Une équipe de recherche dirigée par le professeur Wang Junfeng des instituts Hefei des sciences physiques (HFIPS) de l'Académie chinoise des sciences (CAS) a mis au point un nouveau fluor-19 ( ¹⁹ ) unidimensionnel F) méthode basée sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) pour la détection rapide de l'activité du facteur d'échange de nucléotide guanine Arf6 (GEF).

Leurs résultats ont été publiés dans Analytical Chemistry le 6 juin.

Les petites GTPases (sGTPase) sont impliquées dans des cascades de signaux qui contrôlent un large éventail de réponses cellulaires. Toutes les sGTPases peuvent être trouvées dans deux états :un état inactif dans lequel la petite GTPase est liée à la guanosine diphosphate (GDP) et un état actif dans lequel elle est liée à la guanosine triphosphate (GTP). Le cycle de la GTPase formé par l'interconversion entre les deux états est strictement régulé par les facteurs d'échange de nucléotides guanine (GEF) et les protéines activatrices de la GTPase (GAP).

La mutation ou la régulation anormale des protéines sGTPase ou de leurs GEF/GAP respectifs sont étroitement liées à de nombreuses maladies, dont le cancer. Par conséquent, il est important de détecter l'activité de ces protéines GEF/GAP à la fois in vitro et in vivo.

Dans cette étude, les chercheurs ont incorporé l'acide aminé non naturel tfmF spécifiquement dans Phe47 de la sGTPase Arf6, une position située dans le domaine de commutation ARF6 dont la conformation change le plus au cours du cycle de la GTPase. Et ils ont développé le 1D ¹⁹ Méthode basée sur la RMN F pour détecter l'activité du GEF dans un système de protéines purifiées ou en présence de lysats cellulaires.

Pour un test d'activité GEF, l'échantillon d'Arf6-F47 tfmF chargé de GDP a été placé dans le spectromètre dès que possible après l'ajout d'un GEF et d'un GTP. Une série séquentielle de 1D ¹⁹ Les spectres RMN F ont été collectés. Le signal de Arf6-F47 tfmF dans l'état lié au GTP a été traité et intégré. Les courbes cinétiques d'échange ont ensuite été tracées et ajustées à une courbe de croissance exponentielle monophasée pour extraire le taux.

"Cette stratégie pourrait potentiellement être utilisée pour surveiller le changement conformationnel d'Arf6 ou d'une autre sGTPase", a déclaré Wu Bo, premier auteur de l'étude, "elle peut détecter les activités des protéines régulatrices des sGTPases dans des environnements physiologiques et pathologiques". + Explorer plus loin

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