La coloration de Gram est une procédure de coloration différentielle qui montre quelles bactéries sont Gram-positives ou Gram-négatives en fonction de leur couleur de coloration. L'alcool acétone est un réactif utilisé dans ce processus pour fournir la différenciation des couleurs. Les bactéries Gram-positives ont une épaisse couche de peptidoglycane et une coloration pourpre, tandis que les micro-organismes Gram-négatifs ont une couche peu ou pas de peptidoglycane et colorent en rose.

Primaire Stain-Crystal Violet

Une fois un échantillon bactérien est préparé, le cristal violet est utilisé pour colorer l'échantillon en premier. À ce stade, les bactéries Gram-positives et Gram-négatives apparaissent en violet. Habituellement, le violet cristal est appliqué sur la lame pendant 30 secondes avant de laver toute tache excessive avec de l'eau. Le violet cristallisé peut adhérer un peu aux couches de peptidoglycanes, ainsi toutes les taches primaires ne seront pas lavées avec l'eau.
Mordant-Iode

L'iode est ensuite ajouté à l'échantillon pendant une minute . Il agit comme un mordant, qui sert à fixer les colorants dans un processus de coloration. L'iode remplit cette fonction en se liant au cristal violet et en créant un complexe insoluble qui adhère beaucoup mieux à la couche épaisse de peptidoglycane présente dans les cellules bactériennes à Gram positif que le cristal violet seul. Il n'y a pas d'étape de lavage avec de l'eau après l'addition de l'iode.

Décolorant-Alcool

L'acétone ou l'alcool éthylique peuvent être utilisés comme agent décolorant. L'alcool dissout les lipides trouvés dans la membrane cellulaire externe des bactéries Gram-négatives, ce qui permet au complexe cristal-iode de s'échapper de la couche de peptidoglycane plus mince. L'alcool est ajouté pendant 10 à 20 secondes; il est versé sur la lame jusqu'à ce que tout l'iode soit éliminé et que le ruissellement soit incolore. À ce stade du processus de coloration de Gram, les bactéries Gram-négatives sont incolores tandis que les bactéries Gram-positives conservent encore le cristal violet. Une fois terminée, la lame doit être rincée avec de l'eau pour arrêter l'effet décolorant.

Contre-colorant-Safranin

La Safranine est ensuite ajoutée pour augmenter la visibilité et le contraste avec les bactéries Gram-négatives incolores. La coloration fait apparaître ces bactéries en rose sous le microscope. Comme la tache est ajoutée à l'ensemble de l'échantillon, elle colore également les bactéries Gram-positives, mais la couleur plus foncée du cristal violet cache la couleur rose safranine plus claire. Une fois que l'échantillon de la lame a été inondé avec de la safranine pendant environ une minute, de l'eau est utilisée pour enlever toute tache qui n'a pas adhéré aux cellules bactériennes.