Figure 1. A) Les splénocytes ont été isolés à partir de rates de souris, et les cellules T et B ont été séparées en utilisant un tri cellulaire activé magnétique (MACS). Les cellules ont ensuite été étalées dans 384 puits et plus de 10, 000 molécules fluorescentes différentes ont été criblées à l'aide de DOFLA. B) L'image au microscope à fluorescence montre que CDgB colore les cellules B mais pas les cellules T. C) Graphique de cytométrie en flux de fluorescence CDgB vs SSC entre les populations de lymphocytes T et B. Crédit : Institut des sciences fondamentales
Le sang humain contient plusieurs composants différents, y compris le plasma, globules rouges (GR), globules blancs (WBC), et plaquettes. Parmi ceux-ci, Les globules blancs sont divisés en de nombreuses sous-catégories, chacune avec des fonctions et des caractéristiques uniques, tels que les lymphocytes, monocytes, neutrophiles, et d'autres. Les lymphocytes sont ensuite subdivisés en lymphocytes T, Lymphocytes B, et les cellules NK. Distinguer et séparer les différents types de ces cellules est très important dans la réalisation d'études dans le domaine de l'immunologie.
La discrimination des différents types de cellules immunitaires se fait généralement par cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), qui permet d'identifier des populations de cellules distinctes en fonction de leur taille, granularité, et la fluorescence. Alors que la taille et la granularité seules ne peuvent pas distinguer les cellules avec des paramètres physiques similaires, différents types de cellules immunitaires présentent une combinaison distincte de récepteurs immunitaires à la surface des cellules. Par exemple, les lymphocytes T et les lymphocytes B expriment CD3 et CD19, respectivement. Par conséquent, les cellules immunitaires à identification fluorescente se sont appuyées sur la coloration des cellules à l'aide de plusieurs anticorps dirigés contre différents récepteurs. On a longtemps pensé qu'il était impossible de distinguer différents types de cellules immunitaires sans utiliser ces anticorps.
Cependant, des recherches novatrices et révolutionnaires réalisées par les scientifiques du Centre d'auto-assemblage et de complexité de l'Institut des sciences fondamentales, Corée du Sud, peut-être juste changé cela. Les chercheurs ont utilisé une approche de bibliothèque de fluorescence orientée vers la diversité (DOFLA) pour cribler plus de 10, 000 molécules fluorescentes différentes utilisant les lymphocytes B et T séparés de rates de souris. De là, ils ont réussi à découvrir une nouvelle sonde fluorescente capable de discriminer les lymphocytes B des lymphocytes T sans que le récepteur cellulaire ne cible les anticorps.
Figure 2. A) Structure de la molécule CDgB. B) Le CDgB libre non lié forme des agrégats en solution, qui se dissocie lorsqu'ils se fixent sur les membranes lipidiques. Crédit : Institut des sciences fondamentales
Les chercheurs ont appelé la nouvelle sonde CDgB, qui signifie composé de désignation vert pour les lymphocytes B. CDgB est une molécule lipophile qui contient un composant fluorescent attaché à une chaîne hydrocarbonée. Comme CDgB contient à la fois un groupe fluorescent polaire et une queue hydrocarbonée, cela signifie que les molécules de colorant CDgB libres et non liées forment des agrégats similaires aux micelles dans la solution et présentent un faible niveau de fluorescence de fond. Lorsqu'ils se fixent à la surface des cellules, cependant, les agrégats se dissocient et provoquent un pic dans les signaux de fluorescence. En outre, la nature lipophile du colorant signifie que le colorant ne se lie pas à une cible protéique, et se localise à la place directement dans la structure de la membrane lipidique. Selon les chercheurs, c'était "le premier exemple à rapporter un tel type de mécanisme de distinction cellulaire".
Figure 3. A) Différence dans la composition lipidique membranaire entre les cellules B et les cellules T. B) CDgB colore sélectivement les membranes lipidiques des cellules B qui possèdent une longueur de chaîne PC plus courte et un pourcentage plus faible de cholestérol. C) CDgB montre une fluorescence plus élevée dans les cellules B immatures (CDgB++) que dans les cellules B matures (CDgB+) ou d'autres lymphocytes (CDgB-). Crédit : Institut des sciences fondamentales
Le CDgB est capable de cibler sélectivement les membranes cellulaires des lymphocytes B par rapport aux lymphocytes T ou aux cellules NK. Les chercheurs ont cherché à optimiser la sélectivité du CDgB en testant différents dérivés des molécules avec différentes longueurs de chaînes hydrocarbonées de 4 à 20 carbones. Il a été constaté que les dérivés CDgB de 14 à 18 carbones présentaient la plus grande sélectivité vis-à-vis des lymphocytes B, avec C18 montrant les meilleurs résultats. Il est devenu plus difficile de distinguer les cellules par fluorescence lorsque la longueur du carbone a été augmentée au-delà de 20. Le fait que la longueur du carbone compte dans la sélectivité a laissé entendre que le mécanisme dépendait de la différence dans les structures membranaires entre les lymphocytes B et T.
Les chercheurs ont en outre élucidé ce mécanisme en effectuant une analyse lipidomique des membranes des cellules B et T. La phosphatidylcholine (PC) constitue la majorité (> 60%) des phospholipides membranaires des lymphocytes B et T. Il a été découvert que les lymphocytes B avaient en général des CP plus courts que ceux des lymphocytes T. En outre, la teneur en cholestérol membranaire des lymphocytes T était environ deux fois plus élevée que celle des lymphocytes B. Ces facteurs confèrent aux lymphocytes B une membrane cellulaire plus « flexible », ce qui était considéré comme un facteur crucial expliquant pourquoi les molécules CDgB s'attachent plus facilement aux membranes cellulaires des lymphocytes B par rapport à celles des lymphocytes T. Même parmi les lymphocytes B, il a été constaté que la force de la fluorescence était différente en fonction de la maturité cellulaire. Les progéniteurs des cellules B et les cellules B immatures ont émis des signaux de fluorescence beaucoup plus brillants que les cellules B matures, ce qui est probablement dû à la plus grande flexibilité de la membrane dans les cellules immatures.
Les chercheurs ont en outre conclu que ce nouveau mécanisme de distinction des cellules vivantes orientées vers les lipides (LOLD) peut compléter le mécanisme de distinction des cellules existant pour améliorer notre capacité à distinguer des types de cellules spécifiques à partir de mélanges complexes de différentes cellules. Cette recherche a été publiée dans le Journal de l'American Chemical Society .
