L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide permet une séparation à haute résolution des protéines extraites d'échantillons biologiques, mais il faut plus d'une journée de prétraitement pour récupérer les protéines séparées piégées à l'intérieur du gel pour une détection par spectrométrie de masse. BAC-DROP, notre nouvelle technologie d'électrophorèse, utilise une forme soluble de gel de polyacrylamide, ce qui permet de terminer le prétraitement de l'échantillon en cinq heures environ. La technologie développée permettra le diagnostic rapide des virus et des marqueurs protéiques de la maladie.

La spectrométrie de masse (MS) est une méthode puissante pour l'analyse de biomarqueurs car elle permet une mesure très sensible et précise des molécules cibles dans les échantillons cliniques. L'application de la SEP au diagnostic clinique, comme le dépistage métabolique néonatal, a progressé en mettant l'accent sur les marqueurs métabolites. La mesure MS des protéines est actuellement principalement utilisée pour les études de découverte de nouveaux marqueurs, mais il y a un intérêt croissant pour son application dans le diagnostic de marqueurs cliniques comme alternative aux dosages immunologiques.

La quantification par MS des biomarqueurs protéiques est principalement réalisée par une approche ascendante utilisant des fragments peptidiques obtenus par digestion enzymatique des protéines avec de la trypsine. Les protocoles standards de digestion nécessitent un temps de réaction de plus de 20 heures, ce qui est un facteur limitant dans les flux de travail de préparation d'échantillons.

Bien que la quantification des protéines par MS soit très sensible, le plasma et le protéome sérique sont très complexes, et l'interférence par d'autres composants pose un défi important. Pour une détection de haute précision des marqueurs cibles, des approches pour le pré-retrait des principaux composants protéiques sériques tels que l'albumine ou l'enrichissement sélectif de marqueurs cibles à l'aide de colonnes d'anticorps ont été signalées, mais l'effet hors cible sur les résultats quantitatifs et la difficulté de traiter plusieurs échantillons restent des obstacles.

Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur des gels de polyacrylamide solubles utilisant N, N'-Bis(acryloyl)cystamine (BAC) comme agent de réticulation pour résoudre ces problèmes. Les gels de polyacrylamide réticulé BAC se dissolvent facilement par traitement de réduction, permettant la récupération des protéines qui se sont échappées dans la solution. Nous avons constaté que les protéines récupérées étaient adaptées à une digestion rapide de la trypsine dans des conditions de température élevée, et nous avons réussi à établir une méthode de préparation d'échantillons à haut débit pour la quantification de biomarqueurs basée sur la SEP, que nous avons nommé BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

Le fractionnement du protéome à haute résolution avec BAC-DROP est particulièrement efficace pour la quantification MS de protéines marqueurs cibles dérivées d'échantillons cliniques. En introduisant BAC-DROP dans le flux de travail de quantification basé sur MS de la protéine C-réactive du biomarqueur inflammatoire (CRP), nous avons pu terminer le prétraitement de l'échantillon en seulement 5 heures et quantifier avec succès la CRP à partir d'un échantillon de sérum humain de 0,5 µL. Nous avons également réussi un diagnostic sérologique de l'infection par le virus de l'hépatite B (VHB) par quantification de l'HBsAg combinée avec BAC-DROP et MS. Récemment, l'intérêt pour le diagnostic des infections virales par la SEP a augmenté rapidement, comme en témoigne le diagnostic de COVID-19. L'approche de préparation d'échantillons à haut débit par BAC-DROP montrée dans cette étude sera applicable non seulement au VHB mais également à d'autres échantillons de maladies virales infectieuses.