Zoë Fisher et Katarina Koruza du laboratoire de support de l'ESS Deutération and Macromolecular Crystallization (DEMAX) et de l'Université de Lund ont utilisé des méthodes de diffusion de vapeur pour faire croître de gros cristaux de protéines pour les techniques neutroniques dans le cadre du programme de travail Crystal Growth de SINE2020. Cependant, en plus de pouvoir faire croître des cristaux suffisamment gros pour ces techniques, ils veulent aussi les faire deutérés. Les versions deutérées permettent d'améliorer le rapport signal/bruit, réduction du bruit de fond incohérent et utilisation de méthodes de variation de contraste.

L'équipe a tenté de fabriquer de gros cristaux de diverses protéines, notamment la protéine membranaire Tomate thymidine kinase (TOTK1) et la Superoxyde dismutase (bSOD) qui est présente dans tous les organismes et est impliquée dans le processus de vieillissement. Cependant, bien qu'ils aient réussi à faire pousser de beaux cristaux, ils n'étaient tout simplement pas assez gros—moins de 0,1 mm3.

Mais Zoë et Katarina ont eu beaucoup plus de succès avec les protéines de l'anhydrase carbonique humaine (HCA). La protéine HCA IX en particulier est impliquée dans les métastases cancéreuses et s'est imposée comme une cible possible pour la détection du cancer, imagerie, et traitement. Les techniques neutroniques pourraient fournir des détails sur le site actif - liaison hydrogène, organisation de l'eau, la liaison au ligand - qui aiderait à la conception de médicaments anticancéreux améliorés.

Type sauvage HCA II, HCA IX Mimic (où une partie de la molécule HCA II a été adaptée pour imiter le site actif de la protéine HCA IX) et un variant de surface HCA IX (SV), qui a 6 mutations de surface pour le rendre plus soluble et stable, ont été les protéines choisies pour le projet. Lorsqu'il n'est pas efficace de fabriquer des protéines deutérées en les fabriquant à partir de zéro ou en les achetant dans le commerce, ils sont deutérés via un échange H-D où il est "trempé" dans une solution deutérée (tampon). Pour ce travail, ils ont tous été exprimés dans E. coli dans des conditions hydrogénées et deutérées pour produire des versions H et D.

Ils ont ensuite entrepris de cristalliser les protéines à l'aide de méthodes de diffusion de vapeur afin que les cristaux puissent être étudiés en utilisant à la fois la cristallographie aux rayons X et aux neutrons.

Ce n'était pas une tâche facile. Les protéines sont très sensibles. Il était nécessaire d'utiliser des montages stables pour de longues périodes d'incubation et d'équilibration. La température, taux d'évaporation, Le pH et les concentrations de protéines et de précipitants devaient tous être soigneusement contrôlés à l'aide de puits de cristallisation et d'un contrôle automatique, par exemple, faire varier la température vers le haut et vers le bas selon les besoins.

En outre, afin de fabriquer des cristaux suffisamment gros pour la cristallographie neutronique, vous devez utiliser un grand volume de matière première, typiquement 100-500 microlitres ou 100s de mgs. Ces gros volumes signifient que la croissance cristalline est lente, les conditions devaient donc être contrôlées pendant plusieurs mois à la fois.

Malheureusement, les rendements cristallins obtenus pour les versions deutérées n'étaient pas aussi bons que pour les versions hydrogénées, produisant régulièrement des cristaux de moins en moins nombreux. Il a été découvert que pour certaines protéines deutérées, vous ne pouviez pas du tout utiliser les conditions qui fonctionnaient pour les versions hydrogénées et que les conditions devaient être optimisées davantage pour faire croître des cristaux deutérés.

Mais avec persévérance, Zoë et Katarina ont réussi à faire pousser un cristal HCA (IX) SV sur 1 mm3 et un cristal de 1,8 mm3 d'imitation HCA (IX). Ils ont maintenant pu obtenir des résultats de rayons X et également des résultats de neutrons de LADI à l'ILL et iBIX au Japon.