Des chercheurs de l'Institut de chimie physique de l'Académie polonaise des sciences ont démontré, en utilisant une technique microscopique de super-résolution, comment suivre des réactions chimiques se déroulant dans de très petits volumes. La méthode a été développée en collaboration avec PicoQuant GmbH, et permet d'observer les réactions au sein des organites cellulaires individuels tels que les noyaux cellulaires.

Les mécanismes chimiques responsables des fonctions vitales de la cellule recèlent encore de nombreux secrets – ce n'est que récemment que les chercheurs ont eu les outils pour regarder directement les phénomènes chimiques se produisant dans les cellules vivantes. Cependant, en raison de limitations techniques persistantes, la science manque de connaissances de base sur les valeurs constantes d'équilibre des réactions chimiques dans les cellules. En d'autres termes, les chercheurs ne savent toujours pas quelle quantité d'un produit chimique impliqué dans une réaction cellulaire donnée est sous une forme ayant déjà réagi et quelle quantité est sous une forme n'ayant pas réagi. Ces défis ont été surmontés dans la présente étude. Le groupe de recherche a développé et démontré une modification de la spectroscopie de corrélation de fluorescence à super-résolution.

"Nous avons affaire à des réactions chimiques dans les cellules depuis longtemps. Par exemple, en 2013, nous avons déterminé les coefficients de diffusion de toutes les protéines de la bactérie Escherichia coli, grâce à quoi il est devenu possible de déterminer le taux de réactions ayant lieu avec leur participation. Ici, nous nous sommes intéressés à une problématique similaire dans des situations impliquant de faibles concentrations de réactifs, " explique le Pr Robert Holyst (IPC PAS). " Les réactions biologiques sont généralement réversibles et, où ils se produisent, un certain équilibre dynamique est généralement créé entre la quantité de substances ayant réagi et n'ayant pas réagi. Dans nos tentatives pour déterminer les constantes d'équilibre pour diverses réactions dans les cellules, nous nous sommes tournés vers la spectroscopie de corrélation de fluorescence à super-résolution. Et ici, nous avons rencontré un problème technique intéressant dont la solution nous a ouvert de nouvelles possibilités dans l'étude de la chimie de la vie."

Il existe de nombreuses variétés de microscopie, y compris ceux qui visualisent des atomes individuels. Cependant, lors de l'observation des cellules, la microscopie optique reste imbattable en raison de son faible pouvoir invasif et de sa capacité à visualiser la structure spatiale des organismes vivants. Pendant longtemps, son inconvénient fondamental était sa résolution relativement faible - les contraintes physiques fondamentales (diffraction) rendent impossible la distinction des détails inférieurs à environ 200 nanomètres par les techniques optiques standard.

Un type de microscopie optique est la microscopie à fluorescence. Il s'agit d'introduire un colorant fluorescent dans les sites de l'échantillon biologique étudié, puis balayer l'échantillon avec un faisceau laser focalisé, qui stimule les molécules de colorant à briller. En 1994, Stefan W. Hell a présenté une méthode de dépassement de la limite de diffraction en microscopie à fluorescence au moyen de l'appauvrissement par émission stimulée (STED). STED nécessite un faisceau laser supplémentaire ressemblant à un beignet en coupe transversale. Ce faisceau éteint les zones externes du foyer principal du faisceau laser et réduit par conséquent sa taille à des valeurs inférieures à la limite de diffraction. Avec les méthodes de super-résolution, il est désormais possible de voir des détails spatiaux de seulement 10 nm avec une résolution temporelle allant jusqu'à quelques microsecondes.

La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une nouvelle branche de la microscopie optique pour l'étude du mouvement des molécules. Dans les variétés à super résolution, le foyer du laser a un volume mesuré en dizaines d'attolitres (un attolitre est un milliardième de milliardième de litre). La mesure consiste à mesurer la lumière émise par un colorant fluorescent fixé sur la molécule testée excitée par un faisceau laser. Connaissant la taille du foyer et la durée de fluorescence, et à l'aide des modèles théoriques appropriés, il est possible de déterminer la vitesse de molécules même individuelles.

"Pour quelques temps, il est connu que si la microscopie FCS à super-résolution fonctionne bien lors de l'observation de molécules se déplaçant dans deux dimensions, par exemple. dans les membranes lipidiques, il échoue dans les observations dans les volumes. Temps de diffusion, déterminé à partir de mesures en 3-D, pourraient différer des prédictions des mesures en 2D d'un ordre de grandeur, voire plus. Après quelques mois de recherche, il nous est apparu clairement que ces écarts étaient dus à la manière trop simplifiée de déterminer la taille spatiale du foyer, " explique le Dr Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

Sur la base de leurs propres analyses théoriques et expériences, les chercheurs de Varsovie ont construit un nouveau modèle théorique universel introduisant une correction de la forme spatiale du foyer et prenant en compte son impact sur le rapport signal sur bruit mesuré. L'exactitude du modèle a d'abord été vérifiée par des mesures du taux de diffusion de diverses sondes fluorescentes dans des solutions.

« Nous avons également réalisé des expériences plus poussées. Par exemple, nous avons étudié une réaction réversible dans laquelle les molécules de colorant se sont attachées aux micelles puis se sont détachées au bout d'un certain temps. Le système, composé de boules relativement grosses de molécules de tensioactif réagissant avec les molécules de colorant, conditions reflétées caractéristiques des structures biologiques, " explique Xuzhu Zhang, doctorant (IPC PAS). Les mesures n'étaient pas simples. Si les molécules des deux réactifs se déplaçaient lentement, lors du passage à travers le foyer, le colorant pourrait fusionner/se déconnecter à plusieurs reprises avec/des micelles et la lumière émise serait moyennée.

Mais il pourrait aussi y avoir une variante de l'autre extrême :les réactions de connexion et de déconnexion pourraient se dérouler si lentement que pendant la transition à travers le foyer, il n'y aurait aucun changement dans la relation entre les réactifs – alors il n'y aurait pas de moyenne. "Notre modèle prend en considération non seulement les deux cas extrêmes, mais aussi tous les intermédiaires. Et avec les connaissances à notre disposition sur la taille réelle du foyer, nous sommes capables de changer sa taille et d'examiner expérimentalement tous les cas requis par le modèle à la fois dans le même système chimique et sur le même équipement, ", souligne Zhang.

Une caractéristique importante de la méthode analytique développée à l'IPC PAS est le fait qu'aucun changement d'appareil n'est nécessaire pour son application. Après une adaptation appropriée, la méthode peut être utilisée pour interpréter plus précisément les données enregistrées par les microscopes STED prêts pour FCS déjà en production.