Plus de deux semaines en 2004, Song Zhiwei a été témoin de la mort lente d'une colonie de cellules. Chanson, un bio-ingénieur au A*STAR Bioprocessing Technology Institute (BTI), avait baigné une plaque de cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) avec de la lectine, une protéine toxique dérivée des plantes. Il a ensuite observé les millions de cellules se réduire à une douzaine de survivants. Ils avaient l'air moyen, mais Song savait qu'ils avaient des super-pouvoirs. Le secret était caché dans l'adoucissement.

Les sucres sont essentiels à la vie. Parmi la classe de sucres la plus importante se trouvent ceux qui sont chimiquement liés aux protéines. Ces glycoprotéines sont impliquées dans tout, de la reconnaissance des envahisseurs du système immunitaire à la lubrification des membranes et à la stimulation de la thyroïde. Ils alimentent également une industrie pharmaceutique en plein essor :de nombreux médicaments ménagers contiennent des glycoprotéines, et les sociétés biotechnologiques investissent des ressources importantes dans l'optimisation du sucre de ces protéines afin d'améliorer leur bioactivité et leur puissance thérapeutique.

La lectine est connue pour se lier aux sucres qui pendent aux extrémités des glycoprotéines. Dans l'expérience de Song, seules les cellules CHO mutantes qui ne produisaient pas ces sucres de liaison pouvaient survivre au traitement à la lectine. Cette approche consistant à « voir ce qui colle » est une méthode établie pour identifier des mutants qui peuvent ensuite être produits en masse par l'industrie biotechnologique.

Song a passé les deux années suivantes à mener des expériences de culture cellulaire, des études de biologie moléculaire et des tests génétiques pour prouver que les cellules étaient en fait des mutants. La détermination de la structure exacte des glycoprotéines mutantes a nécessité l'aide de son collègue Lee May May, qui a dirigé le groupe d'analyse chez BTI. May a utilisé des outils de spectrométrie de masse pour déterminer la structure biochimique exacte des protéines produites par les cellules mutantes de Song, révélant qu'ils manquaient de sucres clés. Song avait créé les premières lignées cellulaires mutantes du sucre applicables à la fabrication biotechnologique.

La collaboration s'est depuis étendue à un partenariat de renommée mondiale entre les bio-ingénieurs et les bioanalystes d'A*STAR, faire progresser la compréhension du rôle des sucres dans la maladie.

Flatteries

Les sucres sont la forme de glucides la plus petite et la plus simple, constitué d'unités moléculaires simples ou connectées de carbone, hydrogène et oxygène. Notre sang contient des centaines de types de sucres :certains flottant librement, mais beaucoup plus attachés aux protéines comme les décorations sur un arbre de Noël. Près de 70 pour cent des protéines de notre corps sont glycosylées, ce qui signifie qu'ils ne fonctionneront pas sans leur accoutrement sucré. L'arrangement particulier des sucres, ou glycanes, sur une glycoprotéine détermine comment une protéine se replie et interagit avec d'autres molécules, altère sa solubilité et parfois même les messages qu'il transmet aux cellules. "La cellule dépense une énorme quantité d'énergie pour mettre des sucres sur les protéines, " dit Pauline Rudd, un vétéran dans le domaine de la glycobiologie, qui a rejoint l'équipe analytique de BTI en 2015. "Si vous n'aviez pas de sucres, tu ne survivrais pas."

Les chercheurs ont découvert pour la première fois le rôle essentiel des glycoprotéines au début des années 1900. Un médecin autrichien, Karl Landsteiner, remarqué que le sang humain mélangé avec le sang des animaux, ou même d'autres humains, forme des touffes. Ces amas peuvent obstruer les vaisseaux ou se fissurer pour libérer des protéines toxiques dans le corps. Cependant, Landsteiner a remarqué que certains mélanges ne coagulaient pas. Cette découverte l'a conduit à la classification des groupes sanguins encore utilisée aujourd'hui-A, B, AB et O—et lui a valu le prix Nobel de physiologie ou médecine en 1930. Dans les années 1950, des chercheurs ont déterminé que les sucres exposés à la surface des globules rouges déterminaient à quel groupe sanguin ils appartenaient.

Les analyses de sang ont encouragé la recherche sur les glycoprotéines. Dans les années 1990, les biologistes ont été pris dans l'engouement pour la génétique. Le remède à tout, ils ont posé, était caché dans notre ADN. "Les gènes ont été prétendus être la cause de tout, " dit Rudd, qui a vu le financement de la glycobiologie diminuer. Entre 1998 et 2000, 3,5 milliards de dollars ont été dépensés dans le monde pour la recherche en génomique, y compris l'initiative de séquencer l'ensemble du génome humain. "Il y avait beaucoup d'informations mais cela ne nous a pas donné une voie directe pour comprendre la maladie, " dit Rudd. " Les gens ont commencé à suggérer que les gènes ne font peut-être rien d'autre que coder les protéines. "

Les scientifiques ont porté leur attention sur les nombreuses autres étapes de l'activité biologique jusqu'à ce qu'ils soient de nouveau arrivés aux sucres.

"L'ADN est la première couche d'information. Cette information est transcrite en ARN, qui envoie un message qui est traduit en une protéine avec une fonction, " dit Song. " Les glucides, ou des sucres, sont la dernière couche d'information biologique.

Connaître l'importance des sucres ne les a pas rendus plus faciles à étudier. L'ADN et les protéines sont des structures essentiellement linéaires qui "se recroquevillent dans des formes fantaisistes, " dit Rudd. Les sucres se ramifient en plusieurs chaînes. " Ils sont comme de grands arbres suspendus aux côtés des protéines. " Il faudrait plusieurs années avant que les sucres puissent être analysés avec la précision et la vitesse des gènes et des protéines.

Secouer

En 1989, un tremblement de terre a frappé la Californie. Rudd s'en souvient bien. Elle était au cœur d'une collaboration entre l'Oxford Glycobiology Institute (dirigé par le directeur Raymond Dwek) et une équipe de recherche à Londres, à la recherche de changements dans la manière dont les protéines sont glycosylées chez les patients atteints de maladies auto-immunes. Elle analysait 600 échantillons de la protéine d'immunoglobuline G (IgG), en utilisant un gel spécial pour filtrer les sucres. L'usine qui a produit ce gel a été détruite par le tremblement de terre.

Lorsque l'usine a été reconstruite, son gel n'était pas le même. "C'était complètement inutile, " se souvient Rudd. " Je m'arrachais les cheveux en essayant de faire analyser ces 600 échantillons. "

La nécessité engendre l'invention, Rudd a donc regardé autour de lui et a remarqué les colonnes de chromatographie liquide (LC) qu'elle utilisait pour trier les protéines. Elle a collé une seringue remplie d'un mélange de sucres libérés de ses échantillons de glycoprotéines dans les colonnes. L'appareil LC a filtré les sucres à une résolution beaucoup plus élevée que le processus de gel. "Nous n'y sommes jamais retournés, " elle dit.

Depuis, Rudd a collaboré avec des partenaires privés et institutionnels pour accélérer, automatiser et améliorer la spécificité des techniques de tri et de caractérisation des sucres d'un échantillon. Ce qui prenait un an peut maintenant être fait en une journée. Le flux de travail, bioinformatique et bases de données développées par l'équipe de Rudd au National Institute for Bioprocessing Research and Training (Dublin, Irlande) ont été intégrés à la plate-forme de chromatographie liquide couplée analytique/spectrométrie de masse UNIFI de Waters Corporation, ce qui signifie qu'une grande partie de la complexité de la glycoanalyse est maintenant automatisée. D'où, la glycoanalyse est entrée dans une nouvelle ère de la glycomique, le rapprocher de l'univers big data de la génétique, transcriptomique et protéomique.

« Nous pouvons désormais examiner de grandes cohortes d'échantillons pour mieux comprendre les maladies et soutenir le développement et la production biologiques, " dit Terry Nguyen-Khuong, qui dirige le groupe d'analyse chez BTI. Depuis que j'ai fait équipe avec Rudd, A*STAR a élargi son portefeuille d'analyses pour zoomer sur les sucres et identifier leur emplacement exact, éléments de base et structures de liaison.

Glycoprotéines pharmaceutiques

Les glycoprotéines alimentent une industrie biopharmaceutique de médicaments de 163 milliards de dollars américains dont l'efficacité peut être dictée par les sucres. Par exemple, lorsque l'hormone érythropoïétine se pare de sucres d'acide sialique, elle est dix fois plus efficace pour stimuler la production de globules rouges chez les patients anémiques que l'hormone seule.

Dans le domaine des glycoprotéines, Les cellules CHO comprennent l'ensemble de la main-d'œuvre. Ils peuvent produire toutes les protéines exigées par l'industrie biotechnologique, et peut enrober les protéines de la même manière que les humains.

Avant que Song ne crée ses premiers mutants de cellules CHO, personne n'avait été capable de contrôler la glycosylation des protéines dans les lignées cellulaires productibles en masse. Le groupe de Pamela Stanley aux États-Unis avait peaufiné la glycosylation des cellules CHO pendant des années en utilisant des lignées cellulaires qui vivaient et mouraient sur une boîte de Pétri plate, nourris avec du sang de vache riche en protéines. Song a plutôt développé des mutants en utilisant des cellules dont il savait qu'elles pouvaient se répliquer indéfiniment tout en tourbillonnant dans la sphère 20, Bioréacteurs de 000 litres utilisés dans les usines biopharmaceutiques, sans additifs bovins.

Il a nommé la lignée cellulaire CHO-glycosylation mutant 1 (GMT-1), et depuis, plus de vingt successeurs ont suivi dans l'ordre numérique. Lorsque des outils ont émergé qui ont rendu l'édition de gènes aussi simple que couper et coller des mots sur un écran d'ordinateur, il les a utilisés pour générer plus de mutants.

En GMT-3, il a supprimé un gène nécessaire pour fixer les sucres du fucose aux protéines. Les glycoprotéines GMT-9 manquent des sucres fucose et galactose; et GMT-17 manque de fucose, galactose et acide sialique. L'absence de ces sucres peut dicter la puissance des médicaments. Les cellules de Song produisent des anticorps qui sont jusqu'à cent fois meilleurs pour tuer les cellules cancéreuses que leurs médicaments équivalents sur le marché, comme le rituximab (de marque Rituxan) pour traiter la leucémie. « Les lignées cellulaires sont comparables aux lignées industrielles et sont prêtes à être commercialisées, " dit Song, qui gère une subvention glycomique de 11 millions de dollars singapouriens appelée GlycoSing depuis 2014. Les traitements avec ces anticorps améliorés signifieraient des doses considérablement réduites.

En 2008, André Choo, chercheur au BTI, développé les premiers anticorps capables de tuer spécifiquement les cellules souches embryonnaires, atténuer les inquiétudes concernant les cellules formant des tumeurs chez les patients transplantés. Les anticorps ont depuis été licenciés à plusieurs sociétés.

De nombreuses maladies ont un profil de sucre distinct, un concept que Choo a commencé à exploiter pour le traitement du cancer. Il recherche des anticorps qui ciblent spécifiquement les molécules de sucre aberrantes à la surface des cellules cancéreuses, travailler avec l'équipe de Rudd et Nguyen-Khuong pour les analyser.

Récemment cette année, son équipe a généré un anticorps qui reconnaît les sucres exprimés sur les cellules cancéreuses de l'ovaire. "Dans le passé, nous générions un anticorps sans vraiment savoir ce qu'il ciblait, nous nous concentrons maintenant sur essayer d'obtenir ces anticorps anti-glycane. »

Chez A*STAR, la recherche s'est étendue à la dengue, le virus Zika et les maladies cardiaques. « Tous les grands domaines de la médecine—cancer, maladies infectieuses et problèmes inflammatoires - sont liés aux glycoprotéines, " dit Song, dont les mutants pourraient potentiellement guérir ces maladies.