Lorsque vous travaillez avec la chromatographie liquide haute performance (HPLC), un bon étalonnage est absolument essentiel pour garantir des résultats fiables et de qualité. L'étalonnage correct d'un instrument HPLC commence par l'établissement d'un étalon d'étalonnage approprié. Dans la plupart des cas, l'étalonnage nécessite en fait une série de normes de concentration croissante pour produire ce que l'on appelle une courbe d'étalonnage. Il s'agit d'une ligne tracée et d'une équation associée qui décrit la relation entre la concentration du produit chimique testé et la réponse du détecteur HPLC.

Déterminer le produit chimique que vous souhaitez tester en utilisant la HPLC (le " analyte "). Par exemple, vous pourriez vouloir tester une série de boissons gazeuses pour la teneur en fructose, auquel cas le fructose serait l'analyte.

Obtenir une quantité de substance chimique d'analyte de pureté appropriée. Normalement, la pureté doit être supérieure à 99% et l'analyte doit être acheté auprès d'une entreprise d'approvisionnement en produits chimiques de bonne réputation. Dans le cas du fructose, par exemple, vous achèteriez du fructose pur auprès d'un fournisseur de produits chimiques et non d'une épicerie.

Déterminez les concentrations maximales et minimales prévues de l'analyte dans les échantillons que vous voulez tester sur le marché. HPLC. Dans le cas des boissons gazeuses, vous examinerez les étiquettes des boissons et déterminerez la teneur en fructose la plus basse et la plus élevée parmi les boissons que vous testerez. Gardez à l'esprit que l'échantillon initial (la boisson gazeuse) peut être dilué ou manipulé pendant la préparation pour l'analyse (en fonction de la méthode HPLC utilisée) et que la concentration d'analyte dans les échantillons effectivement injectés dans la HPLC peut être modifiée. C'est la concentration d'analyte dans les échantillons qui doit être prise en compte dans la CLHP.

Déterminer le solvant dans lequel vous allez dissoudre votre analyte pour établir les étalons. Ce solvant doit être capable de dissoudre correctement l'analyte sur une plage de concentration relativement large (au moins aussi élevée que dans les échantillons que vous avez l'intention de tester). De même, ce solvant devrait idéalement être assez similaire à la «phase mobile»: le solvant utilisé pour transporter les échantillons à travers l'instrument HPLC.

Calculer la quantité d'analyte requise pour faire une solution «stock standard» du analyte. Ceci est obtenu en multipliant la concentration requise de l'étalon par le volume désiré. La concentration de l'analyte dans cette solution doit être supérieure d'au moins 10% à la concentration d'échantillon prévue la plus élevée. Si la concentration de fructose anticipée la plus élevée dans un échantillon de boisson gazeuse est de 8 grammes /100 millilitres, alors l'étalon de stock peut être préparé à une concentration de 10 grammes de fructose /100 millilitres. Un volume raisonnable est de 500 millilitres, donc 8/100 mL x 500 mL = 40 grammes de fructose serait nécessaire.

Peser la quantité requise d'analyte à un niveau de précision approprié. Souvent, une valeur de poids en grammes précise à une ou deux décimales est appropriée, mais une plus grande précision peut être nécessaire pour certaines méthodes.

Transférer l'analyte pesé dans une fiole jaugée du volume nécessaire et ajouter le solvant désiré la marque de remplissage sur le flacon. L'utilisation d'une fiole jaugée (plutôt que d'un bécher gradué, par exemple) augmente la précision de la valeur de concentration de l'étalon. Assurez-vous que tout l'analyte est transféré dans le flacon; Utiliser une partie du solvant pour le laver, si nécessaire.

Boucher la fiole jaugée et agiter doucement ou inverser jusqu'à ce que l'analyte soit complètement dissout.

Faire une série de dilutions variables du stock. standard en transférant des volumes connus de l'étalon de stock dans des flacons volumétriques, en utilisant des pipettes pour un transfert précis, puis en ajoutant un solvant. La concentration standard la plus basse devrait être inférieure à l'échantillon le plus bas prévu à analyser. Dans l'exemple de la boisson gazeuse, si la concentration de fructose attendue la plus basse dans un échantillon est de 2 grammes /100 ml, alors un étalon de 1 gramme /100 ml pourrait être fabriqué. Cela serait fait par une dilution de dix fois la norme de stock. La série standard devrait inclure un total de 5 ou 6 concentrations, donc des dilutions supplémentaires pour produire des étalons de peut-être 3, 5 et 8 grammes de fructose /mL seraient nécessaires. Vous disposez maintenant d'une série de solutions standard pour calibrer la CLHP.

Astuce

Il est possible de réaliser des étalons contenant plus d'un analyte si nécessaire. Il est souvent recommandé de filtrer les échantillons d'étalonnage (et les étalons) avant de les injecter sur la CLHP afin d'éliminer toute particule fine susceptible de boucher l'instrument.

Avertissement

Certaines normes se dégradent rapidement après fabriqué. Assurez-vous que vos normes sont remplacées fréquemment si c'est le cas. Respecter toutes les précautions nécessaires lors de la manipulation d'analytes ou de solvants potentiellement dangereux, tels que ceux qui sont toxiques ou inflammables.