1. Extraction et préparation des protéines :
- La première étape consiste à extraire les protéines de l'échantillon d'intérêt. Cela peut être réalisé en utilisant diverses méthodes, telles que la lyse cellulaire ou l'homogénéisation des tissus, suivie d'une centrifugation pour éliminer les débris cellulaires.
- Les protéines extraites sont ensuite quantifiées, généralement à l'aide d'un test de Bradford ou de méthodes similaires, pour garantir une charge protéique égale dans les étapes suivantes.
2. Séparation des protéines :
- L'échantillon de protéine est mélangé avec un tampon de chargement contenant un agent réducteur (par exemple, le bêta-mercaptoéthanol ou DTT) et un colorant de suivi (par exemple, le bleu de bromophénol).
- Le mélange protéique est chargé sur un gel de polyacrylamide pour électrophorèse. Le gel est soumis à un courant électrique, provoquant la séparation des protéines en fonction de leur taille. Les protéines plus petites migrent plus rapidement à travers le gel, tandis que les protéines plus grosses se déplacent plus lentement.
3. Transfert de protéines :
- Après électrophorèse, les protéines séparées sont transférées du gel sur une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène (PVDF). Ce processus, appelé protéine blotting ou électroblot, consiste à placer le gel et la membrane dans un tampon de transfert et à appliquer un courant électrique.
- En conséquence, les protéines sont transférées du gel sur la membrane, créant ainsi une réplique des protéines séparées.
4. Blocage des membranes :
- Pour réduire la liaison non spécifique des anticorps, la membrane de nitrocellulose ou de PVDF est bloquée avec une solution contenant une protéine telle que l'albumine sérique bovine (BSA) ou du lait en poudre écrémé.
- Cette étape de blocage permet de minimiser les signaux de fond et d'améliorer la spécificité de la liaison des anticorps au cours des étapes suivantes.
5. Incubation d'anticorps primaires :
- La membrane est incubée avec un anticorps primaire qui reconnaît spécifiquement et se lie à la protéine d'intérêt. Les anticorps primaires sont généralement générés contre la protéine cible ou un épitope spécifique au sein de la protéine.
- Ces anticorps sont dilués dans un tampon approprié et incubés avec la membrane, leur permettant de se lier à leurs protéines cibles.
6. Lavage :
- Après l'incubation des anticorps primaires, la membrane est soigneusement lavée pour éliminer les anticorps non liés et réduire les signaux de fond. Cette étape de lavage est cruciale pour assurer une détection spécifique de la protéine cible.
7. Incubation d'anticorps secondaires (conjugués à une enzyme rapporteur) :
- Un anticorps secondaire, conjugué à une enzyme telle que la peroxydase de raifort (HRP) ou la phosphatase alcaline (ALP), est utilisé pour détecter les complexes anticorps-antigène primaires sur la membrane.
- Les anticorps secondaires sont spécifiques à une espèce, ce qui signifie qu'ils reconnaissent et se lient aux anticorps primaires produits dans une espèce particulière (par exemple, souris ou lapin).
- L'anticorps secondaire conjugué à l'enzyme se lie à l'anticorps primaire, créant un complexe qui permet l'amplification et la visualisation du signal.
8. Lavage :
- Une autre étape de lavage est effectuée pour éliminer les anticorps secondaires non liés et réduire les signaux de fond.
9. Détection chimiluminescente :
- Pour les anticorps secondaires conjugués à la HRP, un substrat chimioluminescent est ajouté à la membrane. Lorsque le substrat réagit avec le HRP, il émet de la lumière.
- Des systèmes spécialisés de détection par chimiluminescence ou des films à rayons X sont utilisés pour capturer et visualiser les signaux lumineux émis. L'intensité de la lumière correspond à la quantité de protéine cible présente dans l'échantillon.
10. Analyse et interprétation des données :
- Le film radiographique développé ou les images numériques de chimiluminescence sont analysés pour identifier des bandes ou des spots correspondant à la protéine cible.
- La taille et l'intensité de ces bandes peuvent fournir des informations sur le poids moléculaire, l'abondance et les modifications post-traductionnelles de la protéine détectée.
En suivant ces étapes, le Western Blot permet la détection et l’analyse spécifiques d’une protéine d’intérêt dans un mélange complexe de protéines. Il est largement utilisé dans divers domaines de la recherche biologique, notamment la biologie moléculaire, l’immunologie et le diagnostic clinique.
