Il est possible de cloner des organismes entiers tels que Dolly le mouton, mais le clonage d'ADN est différent. Il utilise des techniques de biologie moléculaire pour faire des copies identiques de séquences d'ADN ou de gènes uniques.
En utilisant des méthodes de génie génétique, des segments du code génétique d'ADN sont identifiés et isolés. Le clonage d'ADN copie ensuite les séquences d'acide nucléique dans les segments.
Les copies identiques résultantes peuvent être utilisées pour des recherches ultérieures ou pour des applications biotechnologiques. Souvent, le gène copié code pour une protéine qui peut faire partie des traitements médicaux. La technologie de l'ADN, y compris le clonage de l'ADN, aide à comprendre comment les gènes fonctionnent et comment le code génétique des humains influence le fonctionnement du corps.
Clonage de l'ADN: définition et aperçu du processus
Le clonage de l'ADN est le processus de biologie moléculaire de faire des copies identiques de segments d'ADN situés dans les chromosomes qui contiennent le code génétique des organismes avancés.
Le processus génère de grandes quantités des séquences d'ADN cibles Les deux méthodes utilisées dans le clonage d'ADN sont appelées vecteur plasmidique Dans la méthode PCR, le segment des brins d'ADN à dupliquer est marqué par des enzymes appelées amorces Le vecteur de la méthode fait référence au plasmide utilisé pour contenir le segment d'ADN cible à cloner. Les plasmides sont de petits brins circulaires d'ADN non chromosomique Les plasmides bactériens sont le vecteur utilisé pour insérer le segment d'ADN cible dans les cellules bactériennes pour une duplication ultérieure. Sélection et isolement de l'ADN cible: Avant que le processus de clonage d'ADN puisse commencer, les séquences d'ADN doivent être identifiées, en particulier les débuts et les extrémités des segments d'ADN. De telles séquences d'ADN peuvent être trouvé en utilisant l'ADN cloné existant avec des séquences connues ou en étudiant la protéine produite par la séquence d'ADN cible. Une fois la séquence connue, les enzymes de restriction correspondantes peuvent être utilisées. Couper l'ADN cible avec des enzymes de restriction: Les enzymes de restriction sont sélectionnées pour rechercher le code ADN au début et à la fin des séquences cibles. Lorsque les enzymes de restriction trouvent une séquence codée spéciale de paires de bases appelées sites de restriction, elles se fixent à l'ADN à cet endroit et s'enroulent autour de la molécule d'ADN, coupant le brin. Les segments d'ADN coupés contenant la séquence cible sont maintenant disponibles pour la duplication. Choix du vecteur plasmidique et insertion de l'ADN cible: Un plasmide approprié contient idéalement les mêmes séquences codantes d'ADN que le brin d'ADN à partir duquel l'ADN cible était Couper. Le brin d'ADN circulaire du plasmide est coupé avec les mêmes enzymes de restriction que celles utilisées pour couper l'ADN cible. Une enzyme ADN ligase Insertion du plasmide dans une cellule bactérienne: Une fois que le plasmide contient la séquence d'ADN à cloner, le clonage réel peut avoir lieu en utilisant un processus appelé transformation bactérienne Dans la transformation bactérienne, les cellules hôtes et les plasmides sont incubés ensemble à température corporelle pendant environ 12 heures. Les cellules absorbent certains des plasmides et les traitent comme leur propre ADN plasmidique. Récolte de l'ADN et des protéines clonés: La plupart des plasmides utilisés pour le clonage de l'ADN ont des gènes de résistance aux antibiotiques Lorsque la culture est traitée avec des antibiotiques, seules les cellules qui ont absorbé les nouveaux plasmides survivent. Le résultat est une culture pure de cellules bactériennes avec de l'ADN cloné. Cet ADN peut ensuite être récolté ou la protéine correspondante peut être produite. La méthode PCR est plus simple et copie l'ADN existant en place. Il ne nécessite pas de coupe avec des enzymes de restriction ou d'insertion de séquences d'ADN plasmidique. Cela le rend particulièrement adapté au clonage d'échantillons d'ADN avec un nombre limité de brins d'ADN. Bien que la méthode puisse cloner l'ADN, elle ne peut pas être utilisée pour la production de la protéine correspondante. Déroulage des brins d'ADN: l'ADN dans les chromosomes est étroitement enroulé dans une structure à double hélice. Le chauffage de l'ADN à 96 degrés Celsius dans un processus appelé dénaturation Sélection des amorces: comme pour le clonage d'ADN de vecteur plasmidique, les séquences d'ADN à cloner doivent être identifiées en mettant un accent particulier sur la débuts et fins des segments d'ADN. Les amorces sont des enzymes qui se fixent à des séquences de code ADN spécifiques, et elles doivent être sélectionnées pour marquer les segments d'ADN cibles. Les bonnes amorces s'attacheront aux séquences de molécules d'ADN pour marquer le début et la fin des segments cibles. Recuit de la réaction pour lier les amorces: Le refroidissement de la réaction jusqu'à environ 55 degrés Celsius est appelé recuit Produire des copies identiques du segment d'ADN cible: Dans un processus appelé extension Augmentation du rendement en ADN cloné: Le processus de recuit et d'extension initial crée relativement peu de copies des segments de brin d'ADN disponibles. Pour augmenter le rendement grâce à une réplication supplémentaire de l'ADN, la réaction est à nouveau refroidie pour réactiver les amorces et les laisser se lier à d'autres brins d'ADN. Ensuite, le réchauffement de la réaction active à nouveau l'enzyme polymérase et plus de copies sont produits. Ce cycle peut être répété de 25 à 30 fois. La méthode du vecteur plasmidique repose sur un apport initial suffisant d'ADN pour couper et insérer dans les plasmides. Trop peu d'ADN d'origine entraîne moins de plasmides et un démarrage lent de la production d'ADN cloné. La méthode PCR peut produire une grande quantité d'ADN à partir de quelques brins d'ADN d'origine, mais parce que l'ADN n'est pas implanté dans une cellule bactérienne , la production de protéines n'est pas possible. Pour produire la protéine codée dans les fragments d'ADN à cloner à partir d'un petit échantillon d'ADN initial, les deux méthodes peuvent être utilisées ensemble et peuvent se compléter. Tout d'abord, la méthode de PCR est utilisée pour cloner l'ADN d'un petit échantillon et produire de nombreuses copies. Ensuite, les produits de PCR sont utilisés avec la méthode du vecteur plasmidique pour implanter l'ADN produit dans des cellules bactériennes qui produiront la protéine souhaitée. La biologie moléculaire utilise le clonage de gènes et la réplication d'ADN à des fins médicales et commerciales. Les bactéries avec des séquences d'ADN clonées sont utilisées pour produire des médicaments et remplacer des substances que les personnes atteintes de troubles génétiques ne peuvent pas produire elles-mêmes. Les utilisations typiques incluent: La biotechnologie utilise également le clonage de gènes dans l'agriculture pour créer de nouvelles caractéristiques chez les plantes et les animaux ou améliorer les caractéristiques existantes. Comme plus de gènes sont clonés, le nombre d'utilisations possibles augmente de façon exponentielle. Les molécules d'ADN constituent une petite fraction du matériel dans une cellule vivante, et il est difficile d'isoler les influences des nombreux gènes. Les méthodes de clonage d'ADN fournissent de grandes quantités d'une séquence d'ADN spécifique à étudier, et l'ADN produit des protéines comme il l'a fait dans la cellule d'origine. Le clonage d'ADN permet d'étudier cette opération pour différents gènes de manière isolée. Les applications de recherche et de technologie d'ADN typiques incluent l'examen: Lorsque plus de séquences d'ADN sont clonées, c'est trouver et cloner des séquences supplémentaires plus facilement. Les segments d'ADN clonés existants peuvent être utilisés pour déterminer si un nouveau segment correspond à l'ancien et quelles parties sont différentes. L'identification d'une séquence d'ADN cible est alors plus rapide et plus précise. Dans la thérapie génique Lorsque le gène ne fonctionne pas correctement, une substance importante manque dans la cellule. La thérapie génique essaie de remplacer le gène par une version clonée qui produira la substance requise. La thérapie génique est encore expérimentale et peu de patients ont été guéris en utilisant la technique. Les problèmes consistent à identifier le gène unique responsable d'une condition médicale et à fournir de nombreuses copies du gène aux bonnes cellules. Le clonage d'ADN étant devenu plus répandu, la thérapie génique a été appliquée dans plusieurs situations spécifiques. Parmi les applications récentes réussies, on peut citer: La thérapie génique est l'une des applications les plus prometteuses du clonage d'ADN, mais d'autres nouvelles utilisations sont susceptibles de proliférer à mesure que de nouvelles séquences d'ADN sont étudiées et que leur fonction est déterminé. Le clonage d'ADN fournit la matière première nécessaire au génie génétique dans les quantités nécessaires. Lorsque le rôle des gènes est connu et que leur bon fonctionnement peut être assuré par le remplacement de gènes défectueux, de nombreuses maladies chroniques et même le cancer peuvent être attaqués et traité au niveau génétique à l'aide de la technologie de l'ADN. Contenu connexe:
. Le clonage d'ADN a pour but de produire les séquences d'ADN cibles elles-mêmes ou de produire les protéines codées dans les séquences cibles.
et Réaction en chaîne par polymérase (PCR)
. Dans la méthode des vecteurs plasmidiques, les brins d'ADN sont coupés en utilisant des enzymes de restriction
pour produire des fragments d'ADN, et les segments résultants sont insérés dans des vecteurs de clonage appelés plasmides pour une duplication supplémentaire. Les plasmides sont placés dans des cellules bactériennes qui produisent ensuite les copies d'ADN ou les protéines codées.
. Une enzyme polymérase fait des copies de la partie marquée du brin d'ADN. Cette méthode n'utilise pas d'enzymes de restriction et peut produire de l'ADN cloné à partir de petits échantillons. Parfois, les deux méthodes de la technologie de l'ADN sont utilisées ensemble pour incorporer les meilleures caractéristiques de chacune dans une réaction globale.
La méthode du vecteur plasmidique
trouvés dans de nombreux organismes, y compris les bactéries et les virus.
est utilisée pour favoriser la liaison du segment d'ADN, et les extrémités du segment d'ADN cible se relient aux extrémités coupées de l'ADN plasmidique. L'ADN cible fait maintenant partie du brin d'ADN du plasmide circulaire.
. Les plasmides sont insérés dans une cellule bactérienne telle que E. coli, et les cellules avec les nouveaux segments d'ADN commenceront à produire des copies et les protéines correspondantes.
incorporés dans leur ADN. À mesure que les cellules bactériennes absorbent les nouveaux plasmides, elles deviennent résistantes aux antibiotiques.
La méthode PCR (Polymerase Chain Reaction)
fait que la molécule d'ADN se déroule et se sépare en deux brins. Cette séparation est nécessaire car un seul brin d'ADN peut être cloné à la fois.
. Lorsque la réaction se refroidit, les amorces sont activées et se fixent au brin d'ADN à chaque extrémité d'un segment d'ADN cible. Les amorces agissent uniquement comme des marqueurs, et le brin d'ADN n'a pas à être coupé.
, le TAQ thermosensible une enzyme polymérase est ajoutée à la réaction. La réaction est ensuite chauffée à 72 degrés Celsius, activant l'enzyme. L'enzyme ADN polymérase active se lie aux amorces et copie la séquence d'ADN entre elles. Le processus initial de séquençage et de clonage de l'ADN est terminé.
Utilisation conjointe du vecteur plasmidique et des méthodes de clonage d'ADN par PCR
Exemples de clonage d'ADN pour la biotechnologie
Exemples de clonage d'ADN pour la recherche
Exemples de clonage d'ADN pour la thérapie génique
, un gène cloné est présenté aux cellules d'un organisme dont gène naturel est endommagé. Un gène vital qui produit une protéine nécessaire à une fonction spécifique de l'organisme pourrait être muté, modifié par les radiations ou affecté par des virus.
