La coloration de Gram est une procédure de coloration différentielle qui montre quelles bactéries sont Gram-positives ou Gram-négatives en fonction de leur couleur de coloration. L'alcool acétonique est un réactif utilisé dans ce processus pour fournir la différenciation des couleurs. Les bactéries à Gram positif ont une épaisse couche de peptidoglycane et se colorent en violet, tandis que les micro-organismes à Gram négatif ont peu ou pas de couche de peptidoglycane et se colorent en rose.
Primaire tache-cristal violet

Une fois qu'une lame d'échantillon bactérien est préparé, le cristal violet est d'abord utilisé pour colorer l'échantillon. À ce stade, les bactéries à Gram positif et à Gram négatif apparaissent en violet. Habituellement, le cristal violet est appliqué sur la lame pendant 30 secondes avant de laver tout excès de tache avec de l'eau. Le cristal violet peut adhérer un peu aux couches de peptidoglycane, de sorte que toute la tache primaire ne sera pas lavée avec de l'eau.
Mordant-Iode

L'iode est ensuite ajouté à l'échantillon pendant une minute. Il agit comme un mordant, qui sert à fixer les colorants dans un processus de coloration. L'iode remplit cette fonction en se liant au cristal violet et en créant un complexe insoluble qui adhère beaucoup mieux à la couche épaisse de peptidoglycane présente dans les cellules bactériennes à Gram positif que le cristal violet seul. Il n'y a pas d'étape de lavage à l'eau après avoir ajouté l'iode.
Décolorant-Alcool

L'acétone ou l'alcool éthylique peut être utilisé comme agent décolorant. L'alcool dissout les lipides trouvés dans la membrane cellulaire externe des bactéries à Gram négatif, permettant au complexe cristal violet-iode de s'échapper de la couche de peptidoglycane plus mince. L'alcool est ajouté pendant 10 à 20 secondes; il est versé sur la lame jusqu'à ce que tout l'iode soit éliminé et que le ruissellement soit incolore. À ce stade du processus de coloration de Gram, les bactéries à Gram négatif sont incolores tandis que les bactéries à Gram positif retiennent toujours le cristal violet. Une fois terminée, la lame doit être rincée à l'eau pour arrêter l'effet décolorant.
Contre-teinture-Safranine

De la safranine est ensuite ajoutée pour augmenter la visibilité et le contraste avec les bactéries Gram négatif incolores. La tache fait apparaître ces bactéries roses au microscope. Étant donné que la tache est ajoutée à l'échantillon entier, elle tache également les bactéries à Gram positif, mais le plus foncé du violet cristal cache la couleur rose safranine plus claire. Une fois que l'échantillon de lame a été inondé de safranine pendant environ une minute, de l'eau est utilisée pour éliminer tout excès de tache qui n'a pas adhéré aux cellules bactériennes.