La réaction en chaîne de la polymérase, ou PCR, est une technique qui photocopie un fragment d'ADN en plusieurs fragments - de façon exponentielle. La première étape de la PCR consiste à chauffer l'ADN de façon à le dénaturer ou à le fondre en un seul brin. La structure de l'ADN est comme une échelle de corde dans laquelle les échelons sont des cordes avec des extrémités magnétiques. Les aimants se connectent pour former les échelons, appelés paires de base, et résistent ainsi à être séparés. Chaque fragment d'ADN fond en simples brins à différentes températures. Comprendre comment la structure de l'ADN est maintenue par les parties individuelles de l'ADN permettra de comprendre pourquoi différents fragments d'ADN fondent à des températures différentes et pourquoi des températures aussi élevées sont nécessaires.
Melting! Melting!
La première étape de la PCR consiste à faire fondre l'ADN de sorte que l'ADN double brin se sépare en ADN simple brin. Pour l'ADN mammalien, cette première étape implique généralement une chaleur d'environ 95 degrés Celcius (environ 200 degrés Fahrenheit). A cette température, les liaisons hydrogène entre les paires de bases A-T et G-C, ou les échelons dans l'échelle d'ADN, se séparent, décomposant l'ADN double brin. Cependant, la température n'est pas assez chaude pour casser l'épine dorsale de phosphate-sucre qui forme les brins simples, ou les poteaux de l'échelle. La séparation complète des simples brins les prépare pour la deuxième étape de la PCR, qui se refroidit pour permettre à de courts fragments d'ADN, appelés amorces, de lier les simples brins.
Fermetures magnétiques
Une raison est l'ADN chauffé à la température élevée de 95 degrés Celcius est que plus le double brin d'ADN est long, plus il veut rester ensemble. La longueur de l'ADN est un facteur qui affecte le point de fusion choisi pour la PCR sur cette partie de l'ADN. Les bases A-T et G-C se couplent dans la liaison d'ADN double brin l'une avec l'autre pour maintenir ensemble la structure à double brin. Plus les paires de bases consécutives entre deux brins simples sont liées, plus leurs voisins veulent également se lier, et plus l'attraction entre les deux brins devient forte. C'est comme une fermeture à glissière faite de petits aimants. Lorsque vous fermez la fermeture à glissière, les aimants auront naturellement envie de se fermer et de rester zippés.
est la quantité de paires de bases GC présentes dans ce fragment. Chaque paire de base est comme deux mini-aimants qui attirent. Une paire faite de G et C est beaucoup plus fortement attirée qu'une paire A et T. Ainsi, un morceau d'ADN qui a plus de paires G-C qu'un autre fragment nécessitera une température plus élevée avant de fondre en simples brins. L'ADN absorbe naturellement la lumière ultraviolette - à la longueur d'onde de 260 nanomètres, pour être exact - et l'ADN simple brin absorbe plus de lumière que l'ADN double brin. Donc, mesurer la quantité de lumière absorbée est un moyen de mesurer à quel point votre ADN double brin a fondu en simples brins. L'effet "glissière magnétique" des paires de bases G-C et A-T est ce qui fait qu'un graphique de l'absorbance de la lumière de l'ADN double brin contre une augmentation de température soit sigmoïdal, en forme de S, et non en ligne droite. La courbe du S représente la résistance au travail en équipe que les paires de bases exercent contre la chaleur car elles ne veulent pas se séparer.
Le point à mi-chemin
La température à laquelle fond une longueur d'ADN La température de fusion est appelée température de fusion, ce qui est indiqué par l'abréviation «Tm». Cela indique la température à laquelle la moitié de l'ADN dans une solution a fondu en simples brins et l'autre moitié est encore sous forme double brin. La température de fusion est différente pour chaque fragment d'ADN. L'ADN des mammifères a une teneur en G-C de 40%, ce qui signifie que les 60% restants des paires de bases sont As et Ts. Sa teneur en G-C de 40% fait fondre l'ADN des mammifères à 87 degrés Celcius (environ 189 degrés Fahrenheit). C'est pourquoi la première étape de la PCR sur l'ADN des mammifères est de le chauffer à 94 degrés Celcius (201 Fahrenheit). Seulement sept degrés de plus que la température de fusion et tous les doubles brins vont complètement fondre en simples brins.
