Déterminez votre échantillon d'ARN en mesurant son absorbance de la lumière ultraviolette (UV). Un spectrophotomètre à nano-goutte utilisera seulement un ou deux microlitres de votre échantillon, que vous pourrez récupérer. D'autres spectrophotomètres nécessitent un échantillon beaucoup plus grand. Le coefficient d'extinction pour les nucléotides à une longueur d'onde UV de 260 nm dans un trajet de lumière de 1 cm est de 20. Sur la base de ce coefficient d'extinction, l'absorbance de 40 ug /ml d'ARN dans les mêmes conditions est de un. En utilisant cette information, vous pouvez calculer la concentration de votre échantillon d'ARN.

Faites une dilution, si nécessaire, de votre échantillon. Une dilution standard pour une microcuvette est de 1:40. Effectuez cette dilution en ajoutant 2μL d'ARN à 78μL d'eau stérile.

Suivez les protocoles de votre spectrophotomètre pour calibrer la machine en utilisant un blanc puis déterminez la densité optique de votre échantillon à une longueur d'onde UV de 260nm.

Multipliez l'absorbance de votre échantillon par votre facteur de dilution par 40 μg d'ARN /ml. L'équation serait: "Concentration d'ARN (μg /ml) = (OD260) x (facteur de dilution) x (40μg d'ARN /ml) /(1 DO260 unité)" (Hofstra.edu) Par exemple: Si vous avez dilué votre échantillon par 1:40 et votre lecture d'absorbance était de 0,08, vous multipliez 0,08 x 40 x 40 = 128 μg /ml = 0,13 μg /μL

Déterminez la pureté de votre échantillon en prenant une autre lecture d'absorbance à une longueur d'onde UV de 280 nm . Le rapport DO 260 /DO 280 indiquera si - et à quel niveau - votre échantillon est contaminé par des protéines ou du phénol. Un résultat de 1,8 à 2,0 indique un ARN de qualité.

Astuce

N'oubliez pas de calibrer votre spectrophotomètre. Exécuter un gel électrophorétique rapide confirmera les résultats de votre spécification.

Avertissement

Ne supposez pas que votre échantillon est pur. Prendre le temps pour un rapport OD260 /OD280 permet d'économiser du temps et de l'argent sur la route.