Selon le site BioWeb de l'Université du Wisconsin, une amorce PCR est un court oligonucléotide synthétique (généralement entre 18 et 25 bases) utilisé pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN dans une technique de biologie moléculaire connue sous le nom de réaction en chaîne par polymérase (PCR). A la fois une amorce directe et une amorce inverse sont nécessaires, conçues pour être des compléments inverses du brin d'ADN, pour flanquer et se lier à la région d'ADN désirée. Lorsque les scientifiques veulent effectuer une recherche sur un gène ou une région spécifique de l'ADN, ils doivent d'abord effectuer une PCR pour acquérir suffisamment de la région cible pour travailler avec. Concevoir des séquences d'amorces pour la région d'intérêt peut être nécessaire si elles ne sont pas déjà disponibles par des recherches publiées antérieurement ou par des moyens commerciaux. Obtenir la séquence nucléotidique du gène ou de la région d'ADN d'intérêt et décider combien de temps vous souhaitez amplifier. L'amorce directe et inverse est conçue pour se lier au début et à la fin du fragment désiré. Typiquement, les méthodes de PCR conventionnelles utilisent des amorces qui encadrent une région entre 100 et 1000 paires de bases, tandis que les méthodes de PCR en temps réel utilisent des fragments d'environ 50 à 200 paires de bases.
Décidez où vous voulez les amorces mentir. Par exemple, vous pourriez vouloir l'emplacement près de l'extrémité 5 'ou 3' de la séquence ou au milieu. Si vous le souhaitez, indiquez l'emplacement des amorces sur un intron.
Suivez les recommandations pour la conception des amorces. L'amplification réussie du produit d'ADN dépend de la qualité des amorces et certaines variables sont essentielles.
Les amorces de conception doivent avoir une longueur de 18 à 24 bases. Vincent R. Prezioso, Ph.D., de Brinkmann Instruments Inc., suggère que cette longueur est suffisamment longue pour être extrêmement spécifique à la région d'ADN désirée, mais suffisamment courte pour se lier (s'anneler) facilement. La température de fusion de l'apprêt (Tm) doit être comprise entre 55 et 80 degrés Celsius, suffisamment basse pour permettre une fusion complète à ou supérieure à 90 degrés Celsius, mais suffisamment élevée pour permettre le recuit. La teneur en GC (pourcentage de Gs et Cs dans la séquence) doit être comprise entre 40 et 60%. L'extrémité 3 'de la séquence d'amorce devrait se terminer par un C ou un G (appelé clamp GC) pour favoriser la liaison, puisque les nucléotides G et C ont des liaisons plus fortes, mais évitent d'avoir trois ou plus Gs ou Cs dans les cinq dernières. bases de la séquence.
Évitez d'avoir des séries de quatre ou plus d'une base (comme ACCCC ...) ou quatre répétitions di-nucléotidiques ou plus (comme ATATATAT ...) parce qu'elles peuvent provoquer une mauvaise mise à niveau. Les amorces de conception sans homologie intra-amorce (plus de trois bases qui se complètent au sein d'une amorce elle-même) ou d'homologie inter-amorce (où les amorce directe et inverse ont des séquences complémentaires). Cela peut causer des auto-dimères ou des dimères d'amorces, où les amorces se lient à elles-mêmes au lieu de se lier à la séquence d'ADN désirée.
Utilisez des ressources en ligne et des sites Web pour aider à la conception d'amorce complémentarité ou le potentiel de faire des structures secondaires comme les épingles à cheveux. Certains sites Web de conception d'amorces comprennent Primer3 du Massachusetts Institute of Technology, Primer-Blast du National Centre for Biotechnology Information et OligoAnalyzer de DNA Technologies intégré.
