Des chercheurs de l'Université Ludwig Maximilian (LMU) ont développé une méthode innovante pour suivre simultanément les processus dynamiques rapides de plusieurs molécules à l'échelle moléculaire.
Les processus au sein de notre corps sont caractérisés par l’interaction de diverses biomolécules telles que les protéines et l’ADN. Ces processus se produisent à une échelle souvent de l’ordre de quelques nanomètres seulement. Par conséquent, ils ne peuvent pas être observés en microscopie à fluorescence, qui a une limite de résolution d'environ 200 nanomètres en raison de la diffraction.
Lorsque deux colorants marquant les positions des biomolécules sont plus proches que cette limite optique, leur fluorescence ne peut pas être distinguée au microscope. Comme cette fluorescence est utilisée pour les localiser, déterminer avec précision leurs positions devient impossible.
Cette limite de résolution a traditionnellement été surmontée dans les méthodes de microscopie à super-résolution en faisant clignoter les colorants et en activant et désactivant leur fluorescence. Cela sépare temporellement leur fluorescence, la rendant reconnaissable et permettant des localisations inférieures à la limite de résolution classique.
Cependant, pour les applications impliquant l’étude de processus dynamiques rapides, cette astuce présente un inconvénient majeur :le clignotement empêche la localisation simultanée de plusieurs colorants. Cela diminue considérablement la résolution temporelle lors de l'étude de processus dynamiques impliquant plusieurs biomolécules.
Sous la direction du professeur Philip Tinnefeld, chimiste du LMU, et en coopération avec le professeur Fernando Stefani (Buenos Aires), les chercheurs du LMU ont développé le multiplexage pMINFLUX, une approche élégante pour résoudre ce problème.
L'équipe a publié un article sur sa méthode dans la revue Nature Photonics. .
MINFLUX est une méthode de microscopie à super-résolution, permettant des localisations avec des précisions de seulement un nanomètre. Contrairement au MINFLUX conventionnel, pMINFLUX enregistre la différence de temps entre l'excitation des colorants avec une impulsion laser et la fluorescence ultérieure avec une résolution inférieure à la nanoseconde.
En plus de localiser les colorants, cela donne un aperçu d’une autre propriété fondamentale de leur fluorescence :leur durée de vie de fluorescence. Ceci décrit combien de temps, en moyenne, il faut à une molécule de colorant pour devenir fluorescente après avoir été excitée.
"La durée de vie de la fluorescence dépend du colorant utilisé", explique Fiona Cole, co-premier auteur de la publication. "Nous avons exploité les différences dans les durées de vie de fluorescence lors de l'utilisation de différents colorants pour attribuer les photons fluorescents au colorant émis sans avoir besoin de cligner des yeux ni de séparation temporelle qui en résulte."
À cette fin, les chercheurs ont adapté l'algorithme de localisation et inclus un modèle d'ajustement multiexponentiel pour obtenir la séparation requise.
"Cela nous a permis de déterminer la position de plusieurs colorants simultanément et d'étudier les processus dynamiques rapides entre plusieurs molécules avec une précision nanométrique", ajoute Jonas Zähringer, également co-premier auteur.
Les chercheurs ont démontré leur méthode en suivant avec précision deux brins d’ADN lorsqu’ils sautaient entre différentes positions sur une nanostructure d’origami d’ADN, ainsi qu’en séparant les mouvements de translation et de rotation d’une nanostructure d’origami d’ADN et en mesurant la distance entre les sites de liaison à l’antigène des anticorps.
"Mais ce n'est qu'un début", déclare Philip Tinnefeld. "Je suis certain que le multiplexage pMINFLUX, avec sa haute résolution temporelle et spatiale, fournira de nouvelles informations sur les interactions protéiques et d'autres phénomènes biologiques à l'avenir."
Plus d'informations : Fiona Cole et al, FRET super-résolu et co-suivi dans pMINFLUX, Nature Photonics (2024). DOI :10.1038/s41566-024-01384-4
Informations sur le journal : Photonique naturelle
Fourni par l'Université Ludwig Maximilian de Munich
