Les changements connus sous le nom de modifications épigénétiques jouent un rôle important dans le développement du cancer. Pouvoir les analyser rapidement et de manière fiable pourrait contribuer de manière significative au développement ultérieur de la thérapie personnalisée. Une équipe de recherche de l'Institut de physiologie de l'Université de Fribourg a réussi à caractériser les modifications chimiques des protéines typiques des modifications épigénétiques à l'aide de l'analyse des nanopores. Les chercheurs ont publié leurs résultats de recherche dans le Journal of the American Chemical Society (JACS ).

Ces dernières années, les nanopores sont devenus un outil largement applicable pour l'analyse des molécules. En raison de leurs propriétés particulières, ils permettent d'analyser la structure des molécules en quelques fractions de seconde :en tant que protéines disposées de manière cylindrique, les nanopores forment de minuscules canaux de seulement quelques millionièmes de millimètre (nanomètre) de diamètre qui peuvent être intégrés dans des biomembranes.

"Pour les expériences, nous appliquons une tension constante à travers la membrane afin que les ions du milieu environnant traversent le pore. Cela crée un courant électrique constant et mesurable avec précision", explique le professeur Jan C. Behrends de la Faculté de médecine. à l'Université de Fribourg, dans le laboratoire duquel les expériences maintenant publiées ont eu lieu. Cependant, lorsqu'une molécule migre dans le pore, le courant est bloqué :plus la molécule est grosse, plus elle est également bloquée fortement.

Une protéine sous les projecteurs de la recherche :H4

Dans le cadre des expériences maintenant publiées, les scientifiques de Fribourg se sont consacrés à l'étude de la protéine dite histone H4. Cette protéine est fermement associée à l'ADN dans toutes les cellules avec un noyau et est l'une des cibles les mieux étudiées des modifications épigénétiques. Une région à l'extrémité N-terminale de la protéine est particulièrement affectée par ces modifications.

"La séquence protéique contient plusieurs fois l'acide aminé lysine", explique Behrends. Des groupes acétyle ou méthyle, par exemple, peuvent être attachés à ces lysines, qui sont désignées K8, K12 et K16 selon leur position dans la chaîne protéique, dans le cadre de modifications épigénétiques. Quelle modification chimique a lieu à quelle position de la lysine est définitivement d'une importance médicale, comme le souligne le physiologiste de Fribourg. "L'acétylation à K16, par exemple, est importante pour le développement humain, tandis que la méthylation à K12 joue un rôle dans le développement de certaines tumeurs de la prostate et des poumons, selon les derniers résultats du Centre médical de l'Université de Fribourg."

Détecter les changements à l'aide d'un nanopore

Dans leurs expériences, Behrends et son équipe étaient désormais capables de distinguer clairement les fragments H4 avec ou sans acétylation, ainsi que les fragments avec une, deux ou trois acétylations. De plus, ils ont réussi à démontrer que le nanopore qu'ils utilisaient était également sensible au site d'acétylation :les fragments d'histone avec un groupe acétyle à K8 bloquaient plus fortement le courant à travers le pore que ceux acétylés à K12, et ceux-ci à leur tour plus fortement que ceux avec une acétylation K16.

"Ce type de sensibilité est surprenant dans la mesure où ces fragments sont identiques en termes de masse et de volume total", explique Behrends. Ainsi, le courant poreux semble être sensible non seulement à la taille, mais aussi à la forme de la molécule. Il était également facile de distinguer les différentes variantes de fragments d'histone doublement acétylés - K8 et K12, K8 et K16, et K12 et K16 - encore une fois, malgré la masse identique. Les fragments H4 méthylés à différents degrés et à différentes positions ont également bloqué le courant à travers le pore à différents degrés, mais pas aussi clairement que les variantes acétylées.

"Nous avons pu montrer pour la première fois grâce à nos expériences que l'analyse des nanopores nous permet de distinguer les molécules non seulement par leur taille, mais aussi par leur forme", explique le responsable de l'étude Behrends. Des simulations de dynamique moléculaire menées par le groupe de recherche dirigé par Aleksei Aksimentiev de l'Université de l'Illinois aux États-Unis, également impliqué dans l'étude, montrent qu'un champ électrique hautement inhomogène à l'intérieur du pore joue un rôle clé dans cet effet.

Vision d'avenir :diagnostics médicaux optimisés

Alors que le séquençage de l'ADN à l'aide de nanopores est déjà établi et commercialisé, le développement de l'analyse des protéines basée sur les nanopores ne fait que commencer, déclare Behrends. "La difficulté avec le séquençage des protéines est que ce sont des molécules avec des modèles de charge très non uniformes." Alors que l'ADN, qui est chargé négativement, migre directionnellement dans le champ électrique et peut ainsi être tiré à travers les pores base par base, les protéines sont constituées de blocs de construction constitués d'acides aminés avec des charges différentes. En conséquence, le mouvement dirigé dans le champ électrique et le "balayage" acide aminé par acide aminé n'est pas possible. Les scientifiques de Fribourg se sont donc appuyés sur une approche différente pour leurs expériences. Au lieu d'un pore avec une courte constriction, comme utilisé dans le séquençage de l'ADN, ils ont utilisé un pore sur mesure avec une sorte de piège moléculaire. "Cela a permis de capturer l'intégralité du fragment protéique en une seule fois", explique Behrends.

Il n'est pas encore clair jusqu'à quelle taille de fragment ce type d'analyse peut être utilisé. Cependant, des expériences supplémentaires montrent que la méthode conviendra également à l'analyse des fragments H4 précédemment utilisés dans la recherche épigénétique. Ceux-ci contiennent 14 acides aminés au lieu des dix utilisés ici, et sont actuellement étudiés pour des modifications épigénétiques avec la spectrométrie de masse en tandem, une technique très élaborée. Les chercheurs espèrent que les nanopores rendront l'analyse beaucoup plus simple, plus rapide et plus rentable, et qu'elle pourra être effectuée à proximité du patient.

La poursuite du développement de l'analyse des nanopores des protéines pour le diagnostic médical et sa mise en œuvre dans des produits et services concrets est également l'un des projets centraux du BMBF Cluster4Future nanodiagBW récemment approuvé, que Behrends dirige avec le professeur Dr. Felix von Stetten du Hahn- Schickard-Gesellschaft, qui est le chef de file de ce projet. + Explorer plus loin

Les nanopores peuvent identifier les acides aminés dans les protéines, la première étape du séquençage