Des chercheurs de la Harvard Medical School ont amélioré la conception de minuscules nanodisques, des modèles synthétiques de membranes cellulaires utilisés pour étudier les protéines qui contrôlent ce qui entre et sort d'une cellule. Les améliorations offrent une vue sans précédent de la façon dont les virus infectent les cellules.

Les nouveaux nanodisques sont plus stables que les versions précédentes et, pour la première fois, peut être fait dans plusieurs tailles et formes précises.

"Nous avons enfin un environnement défini où nous pouvons étudier comment les virus ou d'autres protéines interagissent avec les protéines membranaires et obtenir des détails comme jamais vus auparavant, " dit Gerhard Wagner, le professeur Elkan Blout de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire au HMS et auteur principal de l'étude.

Les améliorations de conception signifient que les scientifiques peuvent désormais observer au microscope comme des virus - dans ce cas, poliovirus—accoster avec les nanodisques, ouvrir un pore et injecter leur matériel génétique.

"L'un des objectifs majeurs de la virologie est de comprendre étape par étape comment les virus pénètrent dans les cellules et de réaliser un" film moléculaire, '", a déclaré le premier auteur Mahmoud Nasr, chercheur au laboratoire Wagner. "L'espoir est que ces nanodisques nous aideront à recueillir plus de détails sur ce processus afin que nous puissions concevoir des vaccins et des médicaments à petites molécules pour interdire l'entrée du virus."

En outre, intégrer différentes protéines dans les nanodisques et les faire tourner dans des spectromètres de résonance magnétique nucléaire (RMN) fournit des images plus nettes des structures et de la dynamique des protéines qu'il n'était possible auparavant, aider les chercheurs à mieux comprendre les fonctions des protéines dans le corps.

Les résultats ont été rapportés dans Méthodes naturelles le 21 novembre.

Boucler la ceinture

Les nanodisques bicouches phospholipidiques sont essentiellement des faisceaux de graisse serrés autour de la taille par une paire de ceintures de protéines. Les graisses, ou des lipides, forment une double couche comme celle de la membrane cellulaire naturelle. Les scientifiques peuvent alors intégrer des protéines membranaires dans la bicouche.

Les nanodisques sont apparus au début des années 2000 comme une alternative aux autres substituts membranaires surdimensionnés ou instables ou nécessitant des détergents, qui interfèrent avec la dynamique naturelle des protéines. Mais les nanodisques ont présenté leurs propres problèmes. Par exemple, les chercheurs ne pouvaient pas les faire dans des tailles cohérentes, rejeter les résultats des tests.

L'équipe de Wagner a reconnu que le problème résidait probablement dans le fait que les ceintures de protéines entourant les nanodisques se sont ouvertes, de sorte que les disques gonflés avec des quantités inégales de lipides.

Assez sur, quand les scientifiques ont fait de la chimie de fantaisie pour boucler les ceintures, les nanodisques sont sortis dans une gamme de taille beaucoup plus étroite. Les disques ont également mieux tenu ensemble dans le temps et aux températures élevées nécessaires aux expériences de RMN.

Les chercheurs ont découvert qu'ils pouvaient raccourcir ou allonger les ceintures tout en les refermant, permettant aux nanodisques d'être dimensionnés sur mesure pour s'adapter à des protéines membranaires spécifiques. Jusque là, ils ont fait des disques avec des diamètres de 9, 11, 15 et 50 nanomètres.

Pouvoir contrôler la taille des nanodisques étend l'utilité des outils pour une gamme de protéines et de technologies. La RMN nécessite de petits disques et des protéines, par exemple, tandis que la microscopie électronique a souvent besoin de gros.

"Vous ne pouvez pas utiliser de petits nanodisques pour étudier d'énormes complexes protéiques ou pour examiner des virus, qui ont besoin d'une surface minimale pour former un pore, " a déclaré Nasr.

La plupart des nanodisques sont circulaires, bien que les scientifiques bricolent également avec un éventail de formes polygonales, des triangles aux hexagones.

"Nous espérons qu'en s'assemblant plus efficacement que les nanodisques circulaires, les nanodisques polygonaux, surtout si on peut en faire des plus petits, nous aidera à faire pousser de bons cristaux, qui nous fournit un autre moyen de résoudre les structures des protéines membranaires que nous y intégrons, " a déclaré Nasr.

Viseur viral

Au bout du couloir du labo de Wagner, James Hogle, le professeur Edward S. Harkness de chimie biologique et de pharmacologie moléculaire au HMS, et son boursier postdoctoral Mike Strauss se heurtaient à des barrages routiers en essayant d'apprendre à quel point les virus simples, comme les poliovirus, entrer dans les cellules.

"Quelque chose doit traverser la membrane, " a déclaré Hogle. Il y avait des preuves que les poliovirus ont ouvert des pores dans la membrane et n'ont envoyé que leur matériel génétique à travers, mais les systèmes modèles que les chercheurs utilisaient, appelés liposomes, étaient trop irrégulières et instables pour montrer ce qui se passait dans la membrane.

"Nous ne pouvions pas voir les morceaux qui nous intéressaient, " dit Hogle.

Désireux de savoir si les nanodisques modifiés offraient une meilleure vue, Hogle et Strauss ont fait équipe avec Wagner et Nasr.

D'abord, Nasr a construit des disques de 50 nanomètres suffisamment grands pour contenir toutes les pièces du puzzle. Ensuite, l'équipe a intégré des protéines dans les nanodisques qui se lient aux poliovirus, ajouté des particules de poliovirus au mélange, gelé les échantillons et pris des instantanés à l'aide d'un microscope cryoélectronique.

"Nous avons demandé au virus, 'Viens t'attacher au nanodisque, entrez dans la cellule et montrez-nous ce que vous faites, '", a expliqué Nasr.

Les images montraient des particules virales qui mordaient à l'hameçon—se fixant aux protéines réceptrices, ouvrant ce qui ressemblait à des pores à travers la bicouche lipidique et libérant leur ARN comme s'ils essayaient d'infecter une vraie cellule.

"Personne n'avait vu un tel pore auparavant, " a déclaré Nasr.

Les chercheurs n'ont pas encore confirmé que les objets qu'ils voient sont vraiment des pores, mais, Hogle a dit, "Nous savons qu'ils sont là parce que l'ARN traverse."

"Ils ressemblent vraiment à des pores, " ajouta-t-il. " Comme on dit, 'S'il marche comme un canard, et cancane comme un canard…'"

Nasr essaie maintenant de fabriquer des disques de 30 nanomètres encore mieux adaptés pour aider l'équipe de Hogle à déterminer la structure du complexe poliovirus/protéine réceptrice et à approfondir ce qui se passe dans la membrane.

"Les nanodisques sont une technique passionnante, " a déclaré Hogle. "Je ne peux pas imaginer une autre façon de voir à quoi ressemble le pore. Mahmoud a été très intelligent pour les faire fonctionner et créer un système qui ouvre la porte à une grande variété d'études."

Les chercheurs espèrent que leurs premiers résultats encourageront d'autres à utiliser les nanodisques pour examiner de nombreuses interactions virus/récepteurs. Déjà inondé de demandes de collaboration, Le groupe de Wagner a mis à disposition une collection de ceintures de protéines et publie un protocole détaillé afin que d'autres laboratoires puissent construire eux-mêmes les nanodisques.

Détail de la structure

Au-delà de l'étude de l'entrée virale, L'équipe de Wagner a démontré que les nanodisques peuvent améliorer les résultats de RMN et permettre d'étudier davantage de protéines membranaires par RMN. Ceux-ci incluent les récepteurs couplés aux protéines G, qu'environ 40 pour cent des médicaments d'aujourd'hui sont conçus pour cibler.

« Avec cette technique, nous pouvons obtenir des spectres fantastiques, " dit Wagner.

Parce que les nanodisques ne se décomposent pas à haute température, "nous pouvons faire des expériences RMN pendant des semaines, et les GPCR ne se dégradent pas, " a déclaré Nasr.

Les nanodisques semblent également stabiliser les protéines qu'ils contiennent.

"Ils sont très résistants aux enzymes qui coupent les protéines et les attaquent, " a déclaré Wagner.