Une approche innovante de l'étalonnage des microscopes de haute technologie permet aux chercheurs de suivre le mouvement de molécules individuelles en 3D à l'échelle nanométrique.
Une équipe de recherche de l'Université de Stanford, dirigé par W. E. Moerner, prolonge les travaux qui ont valu à Moerner et à ses collègues Eric Betzig et Stefan W. Hell le prix Nobel de chimie 2014. Betzig et Moerner ont été les pionniers du développement de l'imagerie à super-résolution, qui a dépassé la limite de diffraction de la microscopie optique en utilisant pour la première fois la fluorescence de molécules uniques. Le nouveau travail, publié dans le journal à fort impact de The Optical Society Optique , démontre une nette amélioration de la précision de cette technique d'imagerie et du suivi des molécules en trois dimensions.
Suivre le mouvement des molécules, former des formes et interagir au sein des cellules et des neurones du corps offre une nouvelle vision puissante des processus biologiques clés tels que la signalisation, division cellulaire et communication neuronale, qui ont tous un impact sur la santé des personnes et leur susceptibilité aux maladies.
Capitaliser sur une transformation en microscopie
La microscopie à super-résolution utilise des lasers pour exciter la fluorescence de molécules uniques dans des conditions où seules quelques-unes émettent à la fois, surmonter la limite de résolution traditionnelle pour la microscopie optique fixée par la limite de diffraction de la lumière.
"Avec l'avènement de l'imagerie à super-résolution, nous avons amélioré la résolution d'un facteur 5 à 10 au-delà de la limite de diffraction – de 200 nanomètres à 40 voire 10 nanomètres, " Moerner a déclaré. " Ce nouveau monde de résolution considérablement augmentée apporte une grande transformation dans la façon dont le système optique fonctionne. "
Cependant, les techniques d'étalonnage précédentes pour la microscopie à super-résolution n'étaient pas suffisamment précises pour les mesures 3D de molécules individuelles. La nouvelle méthode d'étalonnage utilise un réseau de nanotrous pour corriger les distorsions optiques sur l'ensemble du champ de vision d'un microscope à grand champ.
Gérer la distorsion
Lors de l'imagerie à l'échelle de molécules uniques, un seul point de lumière provenant d'une molécule peut généralement être localisé avec une précision d'environ 10 nanomètres. À des résolutions aussi élevées, toutes petites imperfections dans un système optique introduisent des distorsions d'image, ou aberrations, ce qui peut fausser considérablement les mesures, notamment en 3D. Les erreurs résultantes pourraient faire la différence entre interpréter deux molécules comme interagissant ou simplement être proches l'une de l'autre.
Alors que beaucoup utilisent des billes fluorescentes pour calibrer les microscopes 3D, Alex de Diezmann, doctorant au Moerner Lab, Université de Stanford, a adopté une approche différente. Il a créé une série de trous dans un film métallique, chacune inférieure à 200 nanomètres et régulièrement espacée de 2,5 microns, à utiliser comme étalon d'étalonnage 3D. Une fois les trous remplis de colorants fluorescents, le réseau pourrait être utilisé pour calibrer les erreurs optiques sur tout le champ de vision du microscope, pas seulement à quelques endroits choisis, comme cela est possible en utilisant des billes fluorescentes. En utilisant cette technique, les chercheurs ont pu corriger des aberrations de 50 à 100 nanomètres à seulement 25 nanomètres.
"Avant cela, les gens ne s'étaient pas explicitement inquiétés de ces aberrations, " a déclaré von Diezmann. " Le fait que nous ayons démontré la présence d'aberrations dépendantes du champ, et ont montré qu'ils pouvaient dégrader les images, est une partie importante de ce travail."
Les chercheurs ont étudié la nouvelle technique d'étalonnage avec des fonctions d'étalement de point à double hélice et astigmate, deux types de modification optique généralement utilisés pour extraire l'emplacement de l'axe z. Bien que les deux fonctions d'étalement des points aient montré des inexactitudes liées à l'axe z qui ont créé une erreur d'environ 20 % dans les mesures 3D, les chercheurs ont corrigé ces aberrations à l'aide de la matrice de nano-trous 3D.
Démontrer les avantages pour l'étude des protéines dans les bactéries
Les chercheurs appliquent maintenant la nouvelle technique d'étalonnage 3D à toutes leurs études de suivi de molécule unique et de microscopie à super-résolution. Par exemple, von Diezmann l'utilise pour étudier la localisation des protéines dans des bactéries qui ne mesurent que deux microns de longueur. Avec la technique de calibrage 3D, il peut mesurer et suivre avec précision des protéines de signalisation clés dans des nanodomaines qui ne mesurent que 150 à 200 nanomètres.
Les chercheurs soulignent que la correction des aberrations dépendantes du champ et d'autres types d'aberrations devient de plus en plus importante à mesure que les techniques de microscopie optique évoluent pour imager plus profondément dans les cellules, par exemple.
"Nous avons étudié cette approche pour quelques cas, mais il peut être utilisé avec n'importe quelle microscopie de super-résolution ou de localisation qui nécessite des mesures 3D très précises, " a déclaré von Diezmann. " Ce sera passionnant de voir d'autres groupes l'utiliser pour comprendre comment leur technique particulière est affectée par les aberrations dépendant du champ. En tant que communauté, peut-être pouvons-nous trouver des moyens encore meilleurs de traiter ces aberrations."
Les chercheurs ont produit un outil d'étalonnage 3D en créant un réseau de trous à l'échelle nanométrique remplis de colorant fluorescent. Dans un), l'éclairage à grand champ (vert) traverse la lamelle de verre dans un nanotrou gravé dans une couche d'aluminium. La solution de colorant fluorescent comble les trous, et les points lumineux résultants (orange) sont détectés par le bas. La figure (b) montre une image au microscope électronique à balayage des trous, which are each 200 nanometers or less in diameter.
