La lumière - et toutes les vagues - peuvent se plier aux coins des obstacles trouvés sur son chemin. A cause de ce phénomène, appelé diffraction, il est impossible de focaliser la lumière sur un point inférieur à la moitié de sa longueur d'onde. En d'autres termes, la résolution la plus élevée que l'on puisse théoriquement atteindre à l'aide d'un microscope optique est d'environ 250 nm, une barrière appelée limite de diffraction. Malheureusement, cette résolution n'est pas suffisante pour observer des structures cellulaires fines, comme celles que l'on trouve dans les neurones.

Depuis plus d'un siècle, les microscopistes étaient paralysés par cette barrière classique jusqu'à l'invention de la microscopie à fluorescence à super-résolution. Une approche particulièrement puissante a été développée à la fin des années 1990 et a été appelée la microscopie à « épuisement des émissions stimulées » (STED). Cette technique nécessite que l'échantillon cible contienne des fluorophores, qui sont des composés qui absorbent la lumière à une longueur d'onde et la réémettent ensuite à une plus longue. Dans la version la plus simple de la microscopie STED, les fluorophores sont excités dans une tache circulaire par irradiation avec un laser focalisé à diffraction limitée. Puis, une partie en forme de beignet autour du spot est irradiée avec une lumière moins énergétique - le faisceau d'appauvrissement - qui éteint la fluorescence par le processus d'émission stimulée. Ainsi, l'effet net est que seuls les fluorophores au centre du beignet réémettent des photons. Comme cette zone peut être arbitrairement petite, cela permet une microscopie à super-résolution.

Bien que la microscopie STED ait été une véritable percée pour observer la morphologie des neurones vivants à une résolution plus élevée, il y a encore place à amélioration. Dans une étude récente publiée dans Neurophotonique , une équipe de scientifiques dirigée par le Dr U. Valentin Nägerl de l'Université de Bordeaux a développé une méthode d'étalonnage simple mais efficace qui permet une imagerie STED plus précise à des profondeurs tissulaires plus élevées. Leur approche est basée sur l'analyse et la correction d'une des principales sources d'erreur systématique en microscopie STED pour les échantillons biologiques :l'aberration sphérique du faisceau de déplétion.

Lors de l'imagerie d'un échantillon de tissu à des profondeurs supérieures à 40 μm, le faisceau d'appauvrissement subit divers types de défocalisation et de dégradation (aberration) et perd sa forme soigneusement travaillée, ce qui est essentiel à la méthode STED. L'aberration sphérique est le plus grand délinquant et était celui que les chercheurs ont ciblé. Leur stratégie consistait à préparer d'abord un échantillon fantôme de tissu cérébral, un proxy à base de gel avec un indice de réfraction similaire à celui du cerveau réel. Cet échantillon fantôme contenait des fluorophores et des nanoparticules d'or dispersés de manière homogène, ce qui a permis à l'équipe de visualiser et de quantifier clairement comment la forme du faisceau d'épuisement s'est déformée au fur et à mesure qu'il pénétrait plus profondément. Puis, ils ont calculé les pré-ajustements nécessaires qui devraient être apportés au faisceau de déplétion en fonction de la profondeur des tissus afin que sa forme finale corresponde plus étroitement à celle idéale. Les réglages ont été effectués à l'aide d'optiques adaptatives, qui est une technologie développée à l'origine par des astronomes pour améliorer les images télescopiques qui souffrent d'aberrations causées par l'atmosphère terrestre.

Une fois la forme du faisceau de déplétion calibrée selon les tests fantômes, les scientifiques ont procédé à l'imagerie du tissu neural vivant. Ils ont comparé les résultats de la microscopie STED régulière, microscopie STED corrigée, et la microscopie à deux photons, une technique spécialement adaptée à l'imagerie des tissus profonds. Les résultats ont été assez convaincants :les images STED corrigées ont capturé les détails fins des dendrites neurales plus profondes bien mieux que les images STED standard. « En utilisant notre stratégie d'étalonnage, nous avons pu mesurer des structures neuronales aussi petites que 80 nm à une profondeur de 90 m à l'intérieur du tissu biologique et obtenir une augmentation du signal de 60 pour cent après correction de l'aberration sphérique, " dit Nägerl.

Ji Yi, professeur de génie biomédical à l'Université Johns Hopkins remarque que "la microscopie à super-résolution a été principalement appliquée pour les spécimens minces, telles que les cellules monocouches, où la diffusion de la lumière est négligeable. L'équipe dirigée par Valentin Nägerl a mis en œuvre l'optique adaptative dans une microscopie à déplétion à émission stimulée à deux photons (2P-STED), et atteint une résolution de 80 nm de l'imagerie des épines dendritiques des neurones à travers le tissu cérébral de 90 microns. Ceci est remarquable car la super-résolution est difficile à maintenir dans les tissus plus épais, en particulier compte tenu de la qualité hautement diffusante du tissu cérébral. » Yi explique que l'avancée facilitera l'étude des activités et interactions neuronales.

Étant donné que ce nouveau processus d'étalonnage est robuste, simple à mettre en œuvre, et relativement bon marché, il pourrait être facilement intégré dans les pratiques de laboratoire standard pour obtenir de meilleurs résultats avec les microscopes STED, tant que l'échantillon fantôme préparé correspond aux propriétés optiques de l'échantillon biologique. À cet égard, Nägerl déclare, "notre approche ne se limite pas aux prélèvements cérébraux; elle pourrait être adaptée à d'autres tissus aux indices de réfraction connus et relativement homogènes, ainsi que d'autres types de préparations, même potentiellement dans l'intact, cerveau de souris vivant."