Un groupe de recherche dirigé par Takashi Saito, de l'École supérieure de médecine de l'Université d'Ehime, développé un microscope à fluorescence à feuille de lumière à excitation à 2 photons qui (1) abaisse la phototoxicité, (2) étend le champ de vision, et (3) augmente la résolution spatiale. Ce microscope, lorsqu'il est utilisé pour l'observation des poissons medaka, a permis d'observer l'ensemble du corps de l'embryon (champ de vision étendu) à une résolution au niveau cellulaire (haute résolution spatiale) sans affecter la croissance du poisson (faible phototoxicité) sur une période de trois jours de développement embryonnaire. Ce résultat a été publié dans la revue scientifique Communication Nature .

Le microscope à fluorescence est largement utilisé dans le domaine des sciences de la vie pour observer des molécules à l'intérieur d'une cellule de manière non invasive. La microscopie à fluorescence en nappe de lumière permet d'enregistrer des images tridimensionnelles avec une vitesse d'acquisition élevée et une résolution spatiale élevée. Cependant, dans les microscopes conventionnels à nappe lumineuse, il est difficile de limiter les photodommages aux tissus vivants, et également difficile d'obtenir simultanément un large champ de vision et une résolution spatiale élevée (au niveau de la cellule).

Développement d'un grand champ d'excitation à deux photons, microscope à feuille de lumière

Le groupe de recherche de l'université Ehime de Takashi Saito, Sota Takanezawa, et Takeshi Imamura a utilisé le phénomène d'excitation à deux photons comme clé pour résoudre ce problème. Le microscope à excitation à deux photons avec lasers infrarouges permet une imagerie douce (faiblement phototoxique) des organismes vivants. Cependant, parce que la lumière doit être focalisée sur une plage étroite pour induire une excitation à deux photons, la plage d'excitation (au microscope à nappe de lumière, le champ de vision) est étroit. Afin de résoudre cela, les chercheurs ont développé une unité optique d'éclairage simple avec un faisceau de Bessel qui étend la plage de propagation du laser dans la direction de l'axe optique (Fig. 1A). Cette unité peut étirer la longueur du faisceau jusqu'à 600-1000 m tout en maintenant une résolution axiale de 2-3 m lors de l'utilisation d'un objectif NA0.3 à grossissement 10x. En utilisant cette unité optique, ils ont construit une microscopie à feuillets lumineux à excitation à deux photons (Fig. 1B), qui permet d'effectuer une imagerie corps entier des larves de médaka avec une résolution cellulaire (Fig. 1C).

Le medaka est largement utilisé comme organisme modèle pour les vertébrés. Il convient à l'imagerie fluorescente car il est petit et transparent. Pour évaluer l'applicabilité du microscope pour une utilisation sur des organismes vivants, les chercheurs ont effectué une évaluation de la phototoxicité. Cela a révélé des dommages photo réduits par rapport au microscope à feuille de lumière à faisceau gaussien conventionnel. Il est donc suggéré d'être adapté à l'imagerie en direct à long terme. Les chercheurs ont ensuite appliqué une imagerie time-lapse à long terme du medaka transgénique dans lequel l'endothélium lymphatique est marqué avec une protéine fluorescente verte, et a réussi à obtenir une imagerie en direct sur trois jours à des intervalles de cinq minutes (Fig. 2).

Dans cette étude, les chercheurs ont mis au point un nouveau microscope à fluorescence à nappe lumineuse hautes performances. Grâce à cette technologie, les scientifiques peuvent observer presque tous les processus de croissance embryonnaire du poisson medaka avec une résolution cellulaire élevée sur tout le corps du poisson. Cette technologie devrait contribuer à la compréhension au niveau moléculaire du développement embryonnaire, l'élucidation de la pathogenèse des maladies liées au mode de vie, et faire progresser la technologie de développement de médicaments.