une, Diagramme énergétique de STED-SREF. b, Configuration de spectroscopie de STED-SREF. Le mode nitrile de la Rhodamine 800 (Rh800) est utilisé ici. c, Imagerie SREF/STED-SREF de cellules E. coli colorées au Rh800 avec des longueurs d'onde de pompe fixées à 836 nm (hors résonance du mode nitrile) et 838 nm (résonance vibrationnelle du mode nitrile). Le couplage direct de l'appauvrissement par émission stimulée (STED) avec l'imagerie SREF ne permet pas d'obtenir les améliorations de résolution souhaitées. Le fond de fluorescence anti-Stokes (montré dans la pompe SREF =836 nm) a un rôle indésirable dans la prévention de l'adoption directe de la technique de fluorescence à super-résolution. Crédits :Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Une véritable imagerie à super-résolution au-delà de la limite de diffraction reste un défi majeur pour la microscopie Raman en champ lointain, en particulier dans les applications biologiques. Exploiter la fluorescence excitée par Raman stimulée (SREF) comme contraste vibrationnel ultrasensible, une équipe de l'Université Columbia a récemment inventé une nouvelle microscopie vibrationnelle à super-résolution. Leur nouvelle méthode ouvre la super-résolution, Imagerie vibrationnelle multicolore à résolution spectrale nanométrique de systèmes biologiques.
Le développement de techniques d'imagerie à super-résolution pour la microscopie Raman a été une longue quête, qui présente des avantages intrinsèques de spécificité chimique par rapport à son homologue de fluorescence. Malgré l'importance perçue et les efforts de recherche considérables, véritable super-résolution (définie comme diffraction illimitée) L'imagerie Raman des systèmes biologiques dans le champ lointain optique reste difficile en raison du manque de sensibilité pour la diffusion Raman conventionnelle. Par conséquent, les méthodes d'imagerie vibrationnelle à super-résolution rapportées sont basées sur la saturation d'excitation, s'épuiser, ou la non-linéarité d'ordre élevé des transitions Raman. Ceux-ci nécessitent une puissance laser extrêmement intense afin d'obtenir une amélioration de résolution modérée (souvent inférieure à un facteur 2), ce qui inhibe son utilité pour une application biologique.
Dans un nouvel article publié dans Lumière :science et applications , une équipe de scientifiques, dirigé par le professeur Wei Min de l'Université Columbia, ETATS-UNIS, a développé une nouvelle microscopie vibrationnelle à super-résolution exploitant la fluorescence excitée par Raman stimulée (SREF) comme contraste vibrationnel ultrasensible. Le SREF associe l'excitation vibrationnelle à la détection de fluorescence et permet une spectroscopie Raman tout champ lointain avec une sensibilité allant jusqu'à une seule molécule. Cependant, le couplage direct de l'appauvrissement par émission stimulée (STED) avec l'imagerie SREF ne permet pas d'obtenir une imagerie de super-résolution en raison de la présence du fond de fluorescence anti-stokes, qui ne peut pas être épuisé par le faisceau STED.
une, le spectre SREF brut du mode nitrile Rh800 acquis par excitation SREF conventionnelle (courbe rouge) et le spectre FM-SREF sans fond correspondant acquis par excitation FM-SREF. b, l'imagerie FM-SREF et la pré-résonance électronique ont stimulé l'imagerie par diffusion Raman (epr-SRS) de cellules d'E. coli colorées au Rh800. c, la distribution d'intensité correspondante pour FM-SREF et epr-SRS le long des lignes pointillées blanches correspondantes en (b). ré, structures chimiques des deux colorants SREF employés. e, les spectres d'absorption (courbes pleines) et d'émission (courbes tirets) des deux colorants dans l'eau, qui ne sont pas résolubles pour la spectroscopie de fluorescence conventionnelle. F, les spectres FM-SREF des modes nitriles des deux colorants. g, Imagerie FM-SREF multicolore de cellules de S. cerevisiae. Crédits :Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Dans ce nouveau travail, l'équipe a conçu une stratégie de modulation de fréquence (FM) pour supprimer ce bruit de fond à large bande. En modulant temporellement la fréquence d'excitation sur et hors de la résonance vibratoire ciblée mais toujours dans la large largeur de raie de l'arrière-plan, ils peuvent générer une modulation d'intensité sur le signal vibratoire pur (mais pas sur le fond). Le signal vibratoire sans bruit de fond peut être ensuite démodulé par une détection de verrouillage. En comparaison avec le spectre SREF brut typique, le spectre acquis par FM-SREF représente le signal SREF pur, qui permet une imagerie SREF sans arrière-plan à contraste élevé. Ils ont en outre synthétisé de nouveaux colorants SREF édités par isotope pour faciliter l'imagerie biologique FM-SREF multicolore avec un contraste vibrationnel net. Deux couleurs vibratoires sont séparées par FM-SREF avec une diaphonie minimale, ce qui est presque impossible par microscopie à fluorescence conventionnelle. Une telle spécificité chimique de l'imagerie vibrationnelle présente des avantages uniques pour l'imagerie optique multiplexée.
une, le schéma du système de microscopie STED-FM-SREF. b, imagerie des mêmes cellules E. coli colorées au Rh800 par microscopie FM-SREF et microscopie STED-FM-SREF et les distributions d'intensité correspondantes le long des lignes en tirets. c, imagerie du même noyau de cellule Cos7 coloré par le composé A par microscopie FM-SREF et microscopie STED-FM-SREF et les distributions d'intensité correspondantes le long des lignes en tirets. Crédits :Hanqing Xiong†, Naixin Qian†, Yupeng Miao, Zhilun Zhao, Chen Chen, Wei Min.
Finalement, en intégrant STED avec FM-SREF sans arrière-plan, ils ont réalisé une imagerie vibrationnelle super-résolution à contraste élevé avec STED-FM-SREF, dont la résolution spatiale n'est déterminée que par le rapport signal sur bruit. Ils ont démontré une amélioration de la résolution de plus de deux fois dans les systèmes biologiques avec une puissance d'excitation laser modérée. Avec une future optimisation sur l'instrumentation et les sondes d'imagerie, La microscopie STED-FM-SREF est envisagée pour aider une grande variété d'applications biologiques, avec sa superbe résolution, haute sensibilité, contraste vibratoire unique, et la puissance d'excitation biocompatible.
