Chercheurs de l'Unité QWM, Le Dr Hidehito Adaniya (à gauche) et le Dr Martin Cheung (à droite) présentent le nouveau microscope cryoélectronique. Crédit : Institut des sciences et technologies d'Okinawa
Visualiser la structure des virus, les protéines et autres petites biomolécules peuvent aider les scientifiques à mieux comprendre le fonctionnement de ces molécules, potentiellement conduire à de nouveaux traitements pour la maladie. Dans les années récentes, une technologie puissante appelée microscopie électronique cryogénique (cryo-EM), où des échantillons surgelés sont noyés dans de la glace semblable à du verre et sondés par un faisceau d'électrons, a révolutionné l'imagerie des biomolécules. Cependant, les microscopes sur lesquels repose la technique sont prohibitifs et compliqués à utiliser, les rendant inaccessibles à de nombreux chercheurs.
Maintenant, des scientifiques de l'Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University (OIST) ont mis au point un microscope cryoélectronique moins cher et plus convivial, ce qui pourrait finalement mettre la cryo-EM à la portée de milliers de laboratoires.
Dans un processus de construction de six ans, l'équipe a construit le microscope en ajoutant une nouvelle fonction d'imagerie à un microscope électronique à balayage. Ils ont utilisé le microscope hybride pour imager trois biomolécules différentes :deux virus de forme distincte et une protéine de ver de terre.
« Construire ce microscope a été un processus long et difficile, nous sommes donc ravis de ses résultats jusqu'à présent, " a déclaré le Dr Hidehito Adaniya, chercheur dans l'unité Quantum Wave Microscopy (QWM) et co-premier auteur de l'étude, Publié dans Ultramicroscopie . "En plus d'être moins cher et plus simple à utiliser, notre microscope utilise des électrons de faible énergie, ce qui pourrait potentiellement améliorer le contraste des images."
Actuellement, cryo-EM fonctionne en tirant des électrons de haute énergie sur un spécimen biologique. Les électrons interagissent avec les atomes de la biomolécule et se dispersent, changer leur direction. Les électrons diffusés frappent alors les détecteurs, et le motif de dispersion spécifique est utilisé pour construire une image de l'échantillon.
Les deux modes conventionnels d'un microscope électronique à balayage (SEM et STEM, à gauche et au centre) n'ont pas pu générer d'images des biomolécules. Cependant, mode d'imagerie holographique (à droite), peut être utilisé pour imager des biomolécules, comme le virus de la mosaïque du tabac illustré. Crédit : modifié à partir de M Cheung, H Adaniya, Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imagerie holographique électronique en ligne à basse énergie de petites biomolécules incrustées de glace vitreuse à l'aide d'un microscope électronique à balayage modifié. Ultramicroscopie, 209 (2020) 112883, Figure 3.
Mais à hautes énergies, seul un nombre relativement faible de ces événements de diffusion se produit parce que les électrons interagissent très faiblement avec les atomes de l'échantillon lorsqu'ils passent à grande vitesse.
« Les biomolécules sont majoritairement composées d'éléments de faible masse atomique, comme le carbone, azote, hydrogène et oxygène, " a expliqué le co-auteur et chercheur, Dr Martin Cheung. "Ces éléments plus légers sont pratiquement invisibles pour les électrons à grande vitesse."
En revanche, les électrons de faible énergie voyagent plus lentement et interagissent plus fortement avec les éléments plus légers, créant des événements de diffusion plus fréquents.
Cette forte interaction entre les électrons de faible énergie et les éléments plus légers est difficile à exploiter, cependant, parce que la couche de glace entourant l'échantillon diffuse également des électrons, créant un bruit de fond qui masque les biomolécules. Pour surmonter ce problème, les scientifiques ont adapté le microscope pour qu'il puisse passer à une autre technique d'imagerie :l'holographie cryoélectronique.
En mode d'imagerie holographique, le faisceau d'électrons englobe tout l'échantillon, formant une onde de référence et une onde objet. Ces ondes interfèrent alors les unes avec les autres pour former un hologramme, qui est enregistré par un détecteur. Crédit : modifié à partir de M Cheung, H Adaniya, Cassidy, M Yamashita, T Shintake. Imagerie holographique électronique en ligne à basse énergie de petites biomolécules incrustées de glace vitreuse à l'aide d'un microscope électronique à balayage modifié. Ultramicroscopie, 209 (2020) 112883, Figure 2.
Former l'hologramme
En mode holographique, un canon à électrons tire un faisceau d'électrons de faible énergie vers l'échantillon de sorte qu'une partie du faisceau d'électrons traverse la glace et l'échantillon, former une onde objet, tandis que l'autre partie du faisceau d'électrons ne traverse que la glace, formant une onde de référence. Les deux parties du faisceau d'électrons interagissent alors l'une avec l'autre, comme la collision d'ondulations dans un étang, créant un motif distinct d'interférence - l'hologramme.
Sur la base du modèle d'interférence de l'hologramme, les détecteurs peuvent distinguer la diffusion par l'échantillon de la diffusion par le film de glace. Les scientifiques peuvent également comparer les deux parties du faisceau pour obtenir des informations supplémentaires des électrons qui sont difficiles à détecter en utilisant la cryo-EM conventionnelle.
"L'holographie électronique nous fournit deux types d'informations différents - l'amplitude et la phase - alors que les techniques conventionnelles de cryomicroscopie électronique ne peuvent détecter que la phase, " a déclaré le Dr Adaniya. Cette information supplémentaire pourrait permettre aux scientifiques d'acquérir plus de connaissances sur la structure du spécimen, il expliqua.
La glace cristalline se forme lorsque la vapeur d'eau atmosphérique se refroidit et se cristallise au contact de l'échantillon en surfusion. Les chercheurs doivent donc effectuer la procédure de préparation dans une boîte à gants remplie d'azote pour éviter tout contact avec l'eau. Crédit : Institut des sciences et technologies d'Okinawa
Une percée dans la glace mince
En plus de construire le microscope hybride, les scientifiques ont également dû optimiser la préparation des échantillons. Étant donné que les électrons de faible énergie sont plus susceptibles d'être dispersés par la glace que les électrons de haute énergie, le film de glace enveloppant l'échantillon devait être aussi fin que possible pour maximiser le signal. Les scientifiques ont utilisé des flocons d'oxyde de graphène hydraté pour maintenir les biomolécules en place, permettant à des films de glace plus minces de se former.
Les scientifiques ont également dû prendre des mesures spéciales pour empêcher la formation de glace cristalline, ce qui est "une mauvaise nouvelle pour l'imagerie cryo-EM, " a déclaré Cheung.
Avec la configuration actuelle et les échantillons optimisés, le microscope a produit des images avec une résolution allant jusqu'à quelques nanomètres, ce que les chercheurs reconnaissent est bien inférieur à la résolution quasi atomique obtenue par cryo-EM conventionnel.
Mais même avec la résolution actuelle, le microscope remplit toujours un créneau important en tant que microscope de présélection. « Parce que les électrons de faible énergie interagissent si fortement avec la glace, notre microscope moins cher et convivial peut aider les chercheurs à évaluer la qualité de leur glace avant de consacrer un temps précieux et de l'argent à l'utilisation de microscopes cryo-EM conventionnels, " a déclaré le Dr Adaniya.
L'ensemble du processus est simple et rapide, disent les chercheurs. Le mode SEM/STEM aide les scientifiques à localiser le meilleur endroit pour l'imagerie, suivi d'une transition transparente vers le mode holographique. Quoi de plus, la capacité de cette technologie de commutation de mode à être mise en œuvre dans d'autres microscopes électroniques à balayage commerciaux en fait une méthode d'imagerie largement adoptée.
À l'avenir, l'équipe espère améliorer encore la résolution de l'image, en remplaçant le canon à électrons par un autre qui crée un faisceau d'électrons de meilleure qualité. "Ce sera la prochaine étape, " ils ont dit.
