Des chercheurs de l'Université de Columbia ont fait un pas important vers la rupture de la "barrière de couleur" de la microscopie optique pour les systèmes biologiques, permettant une approche beaucoup plus complète, l'étiquetage et l'imagerie à l'échelle du système d'un plus grand nombre de biomolécules dans les cellules et les tissus vivants que ce qui est actuellement possible. L'avancement a le potentiel pour de nombreuses applications futures, notamment en aidant à guider le développement de thérapies pour traiter et guérir la maladie.

Dans une étude publiée en ligne le 19 avril dans La nature , l'équipe, dirigé par le professeur agrégé de chimie Wei Min, rapporte le développement d'une nouvelle plate-forme de microscopie optique avec une sensibilité de détection considérablement améliorée. En outre, l'étude détaille la création de nouvelles molécules qui, lorsqu'il est associé à la nouvelle instrumentation, permettre le marquage et l'imagerie simultanés de jusqu'à 24 biomolécules spécifiques, près de cinq fois le nombre de biomolécules pouvant être imagées en même temps avec les technologies existantes.

"A l'ère de la biologie des systèmes, comment imager simultanément un grand nombre d'espèces moléculaires à l'intérieur des cellules avec une sensibilité et une spécificité élevées reste un grand défi de la microscopie optique, " Min a dit. " Ce qui rend notre travail nouveau et unique, c'est qu'il y a deux pièces synergiques - l'instrumentation et les molécules - qui travaillent ensemble pour combattre cet obstacle de longue date. Notre plateforme a la capacité de transformer la compréhension de systèmes biologiques complexes :la vaste carte des cellules humaines, voies métaboliques, les fonctions de diverses structures dans le cerveau, l'environnement interne des tumeurs, et assemblage de macromolécules, pour en nommer quelques uns."

Toutes les méthodes existantes d'observation d'une variété de structures dans les cellules et les tissus vivants ont leurs propres forces, mais tous sont également entravés par des limitations fondamentales, dont l'existence d'une "barrière de couleur" n'est pas la moindre.

Microscopie à fluorescence, par exemple, est extrêmement sensible et, En tant que tel, est la technique la plus utilisée dans les laboratoires de biologie. Le microscope permet aux scientifiques de surveiller les processus cellulaires dans les systèmes vivants en utilisant des protéines qui sont généralement appelées "protéines fluorescentes" avec généralement jusqu'à cinq couleurs. Chacune des protéines fluorescentes a une structure cible à laquelle elle applique un "tag, " ou colorier à. Les cinq protéines fluorescentes, ou couleurs, généralement utilisé pour marquer ces structures sont BFP (Blue Fluorescent Protein), ECFP (Protéine Fluorescente Cyan), GFP (Protéine Fluorescente Verte), mVenus (protéine fluorescente jaune), et DsRed (protéine fluorescente rouge).

Malgré ses atouts, la microscopie à fluorescence est entravée par la "barrière de couleur, " ce qui limite les chercheurs à voir un maximum de cinq structures à la fois car les protéines fluorescentes utilisées émettent une gamme de nuances indiscernables qui, par conséquent, se répartissent en cinq grandes catégories de couleurs.

Si un chercheur essaie d'observer toutes les centaines de structures et différents types de cellules dans un échantillon de tissu tumoral cérébral vivant, par exemple, elle serait limitée à voir jusqu'à cinq structures à la fois sur un seul échantillon de tissu. Si elle voulait voir plus que ces cinq-là, elle devrait nettoyer le tissu des marqueurs fluorescents qu'elle a utilisés pour identifier et marquer les cinq dernières structures afin d'utiliser ces mêmes marqueurs fluorescents pour identifier un autre ensemble de cinq structures maximum. Elle devrait répéter ce processus pour chaque ensemble de cinq structures maximum qu'elle souhaite voir. Non seulement l'observation d'un maximum de cinq structures à la fois demande beaucoup de travail, mais en nettoyant le tissu, des composants vitaux de ce tissu pourraient être perdus ou endommagés.

"Nous voulons les voir tous en même temps pour voir comment ils fonctionnent seuls et aussi comment ils interagissent les uns avec les autres, " dit Lu Wei, auteur principal de l'étude et chercheur postdoctoral au laboratoire Min. "Il y a beaucoup de composants dans un environnement biologique et nous devons être capables de tout voir simultanément pour vraiment comprendre les processus."

En plus de la microscopie à fluorescence, il existe actuellement une variété de techniques de microscopie Raman utilisées pour observer les structures cellulaires et tissulaires vivantes qui fonctionnent en rendant visibles les vibrations provenant des liaisons chimiques caractéristiques dans les structures. La microscopie Raman traditionnelle produit les couleurs hautement définies qui manquent à la microscopie à fluorescence, mais il manque la sensibilité. En tant que tel, il faut un fort, signal vibratoire concentré qui ne peut être obtenu que par la présence de millions de structures avec la même liaison chimique. Si le signal des liaisons chimiques n'est pas assez fort, visualiser la structure associée est presque impossible.

Pour relever ce défi, Min et son équipe, dont les profs. Virginia Cornish en chimie et Rafael Yuste en neurosciences, a poursuivi un nouvel hybride de techniques de microscopie existantes.

Ils ont développé une nouvelle plate-forme appelée microscopie électronique à diffusion Raman stimulée par pré-résonance (epr-SRS) qui combine le meilleur des deux mondes, alliant un haut niveau de sensibilité et de sélectivité. La technique innovante identifie, avec une extrême spécificité, structures avec une concentration significativement plus faible - au lieu de millions de la même structure nécessaires pour identifier la présence de cette structure en microscopie Raman traditionnelle, le nouvel instrument n'en requiert que 30 pour l'identification. La technique utilise également un nouvel ensemble de molécules de marquage conçues par l'équipe pour fonctionner en synergie avec la technologie ultramoderne. La « palette de couleurs » amplifiée des molécules élargit les capacités de marquage, permettant l'imagerie de jusqu'à 24 structures à la fois au lieu d'être limité par seulement cinq couleurs fluorescentes. Les chercheurs pensent qu'il existe un potentiel d'expansion encore plus poussée à l'avenir.

L'équipe a testé avec succès la plateforme epr-SRS dans le tissu cérébral. « Nous avons pu voir les différentes cellules travailler ensemble, " dit Wei. " C'est la puissance d'une palette de couleurs plus large. Nous pouvons maintenant éclairer simultanément toutes ces différentes structures dans le tissu cérébral. À l'avenir, nous espérons les voir fonctionner en temps réel. » Le tissu cérébral n'est pas la seule chose pour laquelle les chercheurs envisagent d'utiliser cette technique, elle a ajouté. « Différents types de cellules ont des fonctions différentes, et les scientifiques n'étudient généralement qu'un seul type de cellule à la fois. Avec plus de couleurs, nous pouvons maintenant commencer à étudier plusieurs cellules simultanément pour observer comment elles interagissent et fonctionnent à la fois seules et ensemble dans des conditions saines par rapport à des états pathologiques. »

La nouvelle plate-forme a de nombreuses applications potentielles, Min a dit, ajoutant qu'il est possible que la technique puisse un jour être utilisée dans le traitement de tumeurs difficiles à tuer avec les médicaments disponibles. "Si nous pouvons voir comment les structures interagissent dans les cellules cancéreuses, nous pouvons identifier des moyens de cibler plus précisément des structures spécifiques, ", a-t-il déclaré. "Cette plate-forme pourrait changer la donne dans la poursuite de la compréhension de tout ce qui a beaucoup de composants."