La fluorescence est un outil incroyablement utile pour la biologie expérimentale et il est devenu plus facile à exploiter, grâce au travail d'un groupe de chercheurs de l'Université de Chicago.

Le groupe a créé un nouvel outil dans le cadre d'une classe de laboratoire au sein du programme d'études supérieures en sciences biophysiques de l'Université de Chicago, permettant à ses utilisateurs de se concentrer sur le spectre à partir de structures spécifiques au sein d'échantillons.

« Le gros du travail a été fait par des étudiants diplômés au cours de leur premier semestre, " dit Adam Hammond, directeur du programme et maître de conférences dans le programme de sciences biophysiques au Gordon Center for Integrative Sciences. « Leur enthousiasme et leur créativité ont rendu ce projet possible.

Comme le groupe le rapporte cette semaine dans le journal Examen des instruments scientifiques , des éditions AIP, le but de leur instrumentation est d'observer le spectre de la lumière provenant d'une partie d'un échantillon au microscope, mais pas de l'ensemble de l'échantillon.

"L'intérêt d'un microscope est qu'il permet d'observer les variations au sein d'un échantillon, " expliqua Hammond. " Nous voulions pouvoir demander, « Quel est le spectre de cette structure spécifique juste là ? » Ce n'est pas une envie nouvelle et les instruments qui peuvent le faire exister, mais aucun, Pour autant que je sache, aussi simplement que la nôtre."

Au cours de sa première année d'études supérieures, Peter Dahlberg, premier auteur de l'article qui est maintenant à l'Université de Stanford en Californie, construit un microscope à excitation sélective. « Inconsciemment, Je pense que l'idée a commencé alors, " dit-il. " Pourquoi ne pas faire la même chose, mais à l'envers ?"

Comment fonctionne l'outil du groupe ? D'abord, il divise la lumière qui vient d'un échantillon. La moitié va à une caméra pour une imagerie normale et l'autre moitié va à un spectromètre. Mais avant d'arriver au spectromètre, cette moitié passe par quelques composants optiques qui permettent aux utilisateurs de choisir n'importe quelle partie arbitraire de l'image et de bloquer tout le reste.

"Il n'y a rien de compliqué à propos de ces composants optiques - un modulateur spatial de lumière (SLM) entre des polariseurs croisés, " a déclaré Hammond. " Les SLM sont courants maintenant, avec au moins trois dans de nombreux projecteurs numériques modernes. Ils ont un réseau de pixels qui peuvent chacun manipuler la phase de la lumière qui les traverse."

Bien qu'il existe plusieurs astuces que vous pouvez faire avec un SLM, le groupe utilise le plus simple.

« Nous focalisons l'image de l'échantillon sur le SLM et décalons la phase des seuls pixels à partir desquels nous voulons obtenir un spectre, " continua-t-il. " La lumière décalée passe à travers un deuxième polariseur; tout le reste est bloqué. Ensuite, cette lumière est collectée et peut être envoyée à tout type d'instrument optique de votre choix. Pour le moment, nous l'envoyons à un petit spectromètre UV/Vis pour obtenir un spectre complet."

L'instrument du groupe est, peut-être, mieux résumé comme un "outil bourreau de travail". Ses concepts et composants simples peuvent facilement être adaptés à de nombreuses fins différentes et ajoutés aux microscopes existants facilement et à moindre coût.

"Nous avons décidé de le construire pour un usage spécifique :mesurer le décalage spectral des indicateurs fluorescents, " a déclaré Hammond. "Nous n'avons pas vraiment pensé à le rendre polyvalent ou à la manière d'organiser le SLM et les polariseurs lorsque nous avons commencé. Mais nous avons eu une agréable série de réalisations en cours de route. »

Une de ces réalisations était que leur instrument pouvait également être utilisé pour des mesures d'absorbance.

"Souvent, les échantillons les plus importants sont minuscules et difficiles à créer ou à purifier, comme des formes cristallines, " dit-il. " C'est un travail ardu de purifier les deux types l'un de l'autre en quantité suffisante pour remplir une cuvette. Lorsque vous mettez le mélange sur une lame de microscope, ça devient plus facile. Les cristaux peuvent être mesurés un à la fois, de même que les cellules qui expriment des chromophores variables (molécules responsables de la couleur). Cela ouvre un tout nouveau domaine qui ne faisait pas partie de notre plan initial."

L'instrument du groupe peut "prendre le spectre complet d'une ou plusieurs régions d'intérêt définies par l'utilisateur tout en capturant simultanément des images de fluorescence standard de l'ensemble du champ de vision, " dit Hammond. " Donc, ce que vous pouvez en faire dépend de l'échantillon. Nous l'utilisons maintenant pour suivre les sondes fluorescentes pour le pH et le calcium. Mais un exemple d'application très différente est sa capacité à identifier des micro-organismes individuels dans un échantillon mélangé par leur empreinte d'absorbance. »

Quelle est la prochaine étape pour les chercheurs ?

"En utilisant une source d'excitation pulsée, la durée de vie de fluorescence d'une sonde pourrait être mesurée à partir d'une région d'intérêt sélectionnée, " a déclaré Hammond. " Une application potentielle intéressante est dans le domaine des neurosciences pour résoudre les potentiels d'action simples avec des colorants qui sont sensibles au potentiel membranaire. Les mesures de durée de vie de fluorescence offrent un avantage par rapport aux mesures de fluorescence directes, car elles sont indépendantes de la concentration de la sonde."