La visualisation des cellules biologiques au microscope vient d'être rendue plus claire, grâce aux recherches menées par l'étudiant diplômé Yifei Jiang et le chercheur principal Jason McNeill du département de chimie de l'Université Clemson.

Avec l'aide de Rhonda Powell et Terri Bruce du Light Imaging Facility de Clemson, l'équipe a pu développer un « commutateur » de nanoparticules qui émet une fluorescence pour affiner la résolution des images microscopiques qui représentent de petites structures cellulaires. Comme récemment publié dans Lettres nano , ce commutateur améliore une méthode d'imagerie qui a remporté le prix Nobel de chimie 2014.

Parce que les structures cellulaires émettent de la lumière à des longueurs d'onde inférieures à 400-700 nanomètres sur le spectre électromagnétique, ils apparaissent souvent flous au microscope optique. Cette contrainte est appelée la limite de diffraction, et cela se produit à cause des propriétés ondulatoires de la lumière. Au fur et à mesure que la lumière contourne les structures des cellules biologiques, il diffracte, ou des virages, à un point que les microscopes optiques ne peuvent pas clairement résoudre. La méthode d'imagerie primée en 2014 - la microscopie de localisation de molécule unique - a été inventée pour dépasser cette limitation.

« La microscopie de localisation de molécule unique est basée sur des « photocommutateurs » moléculaires - des molécules fluorescentes que vous pouvez activer et désactiver, comme un interrupteur, dépasser la limite de diffraction, " dit McNeill. " Avec cette méthode d'imagerie, l'échantillon est imagé une molécule fluorescente à la fois et un ordinateur est utilisé pour construire une image qui est beaucoup plus nette que ce que vous pourriez obtenir avec un microscope optique ordinaire.

La prise, cependant, est que la fluorescence fournie par les photocommutateurs est au mieux faible, avec seulement une légère amélioration de la résolution de l'image. La microscopie de localisation de molécule unique nécessite également un équipement spécialisé qui peut être coûteux à obtenir.

Cue le "buckyswitch" - la version améliorée d'un photocommutateur des chercheurs de Clemson. Ce nouveau type de nanoparticule conserve la capacité on-off du photocommutateur, mais est 10 fois plus lumineux et plus facile à utiliser. Il permet également aux microscopes de capturer des images jusqu'au niveau du térapixel. (C'est l'équivalent d'un billion de pixels, ou un million de mégapixels.)

"Ces nanoparticules sont les premiers photocommutateurs à atteindre une précision jusqu'à environ 1 nanomètre, ce qui améliore considérablement la résolution de l'imagerie super-résolution, " dit Jiang. " Aussi, notre méthode ne nécessite qu'une seule source lumineuse d'excitation, où les techniques de super-résolution conventionnelles nécessitent deux lasers; Donc, nous avons simplifié la configuration du microscope."

Jiang a assemblé le buckyswitch à partir d'un fluorescent, polymère conjugué semi-conducteur complexé avec un dérivé chimique du buckminsterfullerène :une forme de carbone en forme de ballon de football.

"La partie difficile de la fabrication d'une nanoparticule fluorescente que vous pouvez activer et désactiver est qu'il y a beaucoup de zones émettant de la fluorescence à la fois, " a déclaré McNeill. " Dans le cas d'un polymère conjugué fluorescent, il y a des dizaines ou des centaines de segments de chaîne. Vous pouvez essayer de faire beaucoup de petits commutateurs pour chaque segment, mais il est difficile de les éteindre tous en même temps. Vous ne pouvez pas les synchroniser."

En ajoutant le dérivé du buckminsterfullerène, appelé PCBM, à la fabrication de buckyswitches, un « interrupteur principal » est formé qui régule la charge atomique des segments du polymère, synchronisant ainsi la fluorescence. PCBM est capable de saisir les électrons du segment polymère, donnant au segment une charge globale positive. Cette charge positive réduit la fluorescence des segments voisins, qui a un effet domino qui éteint la fluorescence dans l'ensemble de la nanoparticule.

Bruce - dont l'expérience traverse les sujets du génie chimique, biologie appliquée, biologie cellulaire, et expérience dans l'enseignement et l'industrie - compare cette méthode d'imagerie à la vue d'un pont suspendu la nuit.

"Les fils du pont sont souvent illuminés, et quand tu te tiens loin du pont, les lumières ressemblent à une "corde" continue de lumière, au lieu d'ampoules individuelles. Cependant, si vous pouvez faire clignoter les ampoules - de sorte que seules toutes les autres ampoules soient allumées à tout moment - vos yeux peuvent discerner les ampoules individuelles de loin, " a déclaré Bruce. " La base de la microscopie à super-résolution réside dans la capacité de faire " clignoter " les étiquettes fluorescentes tout comme les lumières sur le pont. Le travail effectué par le laboratoire du Dr McNeill est vital pour l'avancement de cette technologie, car il vise à rendre ces clignements individuels beaucoup plus lumineux, afin que nos détecteurs de photons actuels puissent réellement voir les clignotements. Si nous pouvons voir les clignotements avec une caméra ou un autre détecteur de photons, nous pouvons cartographier l'endroit où le clignement se produit, et créer une image où nous pouvons discerner deux points de lumière qui sont à 10-20 nanomètres l'un de l'autre."

Une fois le buckyswitch synthétisé, Jiang l'a testé sur E. coli, mais pas avant d'avoir développé un milieu de croissance unique pour les bactéries. Typiquement, E. coli est cultivé dans des milieux autofluorescents, ce qui signifie qu'il émet naturellement de la lumière. Sans les médias appropriés, la fluorescence du buckyswitch serait obscurcie par la lumière de fond, quelque chose que Powell a souligné.

"Une étude comme celle menée par Yifei nécessitait très peu de fluorescence de fond, J'ai donc recherché des composants multimédias qui seraient moins susceptibles d'être autofluorescents et j'ai préparé une "recette" pour un produit non conventionnel, moins de milieux nutritifs autofluorescents pour la culture bactérienne, " dit Powell, qui a étudié à la fois les sciences biologiques et la microbiologie à Clemson avant de devenir directeur du laboratoire de recherche du Clemson Light Imaging Facility. Powell et Bruce ont également travaillé pour fournir à Jiang l'E. coli pour l'étude.

Une fois que tous les composants nécessaires ont été équarris, Jiang a fixé les commutateurs bucky à nanoparticules à la surface d'E. coli. Comme espéré, les buckyswitchs émettaient de petits éclairs lumineux, ce qui a permis aux chercheurs de déterminer leurs positions précises. Ils ont ensuite reconstitué chaque éclair de lumière pour reconstituer la forme de l'E. coli, donnant une image de super-résolution.

"Nous espérons que cette percée pourra éventuellement aider les chercheurs à s'attaquer à des problèmes difficiles en biologie, conduisant à des percées dans la compréhension et le traitement de la maladie, " a déclaré l'équipe de Clemson.

L'équipe a conçu les buckyswitches pour qu'ils fonctionnent avec des microscopes à fluorescence standard et un logiciel gratuit disponible en ligne, rendre la technologie peu coûteuse et accessible aux laboratoires du monde entier.

leur parution, intitulé "Imagerie à superrésolution améliorée utilisant le bruit télégraphique dans les nanoparticules de semi-conducteurs organiques, " est présenté dans le numéro du 14 juin de Lettres nano .