Les microscopes conventionnels fournissent des informations essentielles sur les échantillons en deux dimensions :le plan de la lame du microscope. Mais plat n'est pas tout cela. Dans de nombreux cas, les informations sur l'objet dans la troisième dimension (l'axe perpendiculaire à la lame du microscope) sont tout aussi importantes à mesurer.

Par exemple, comprendre la fonction d'un échantillon biologique, qu'il s'agisse d'un brin d'ADN, tissu, organe ou organisme microscopique, les chercheurs aimeraient avoir autant d'informations que possible sur la structure tridimensionnelle et le mouvement de l'objet. Les mesures bidimensionnelles donnent une compréhension incomplète et parfois insatisfaisante de l'échantillon.

Aujourd'hui, des chercheurs du National Institute of Standards and Technology (NIST) ont trouvé un moyen de convertir un problème affectant presque tous les microscopes optiques :les aberrations de l'objectif, qui provoquent une focalisation imparfaite de la lumière en une solution qui permet aux microscopes conventionnels de mesurer avec précision les positions des points lumineux sur un échantillon dans les trois dimensions.

Bien que d'autres méthodes aient permis aux microscopes de fournir des informations détaillées sur la structure tridimensionnelle, ces stratégies ont tendance à être coûteuses ou nécessitent des connaissances spécialisées. Dans une approche précédente pour mesurer les positions dans la troisième dimension, les chercheurs ont modifié l'optique des microscopes, par exemple en ajoutant un astigmatisme supplémentaire aux lentilles. De telles modifications nécessitaient souvent une réingénierie et un réétalonnage du microscope optique après sa sortie de l'usine.

La nouvelle méthode de mesure permet également aux microscopes de localiser plus précisément et plus précisément les positions des objets. Les microscopes optiques résolvent généralement les positions des objets dans une région non inférieure à quelques centaines de nanomètres (milliards de mètre), une limite fixée par la longueur d'onde de la lumière qui fait l'image et le pouvoir de résolution des lentilles du microscope. Avec la nouvelle technique, les microscopes conventionnels peuvent localiser les positions des particules émettrices de lumière individuelles dans une région centième aussi petite.

Les chercheurs du NIST Samuel Stavis, Craig Copeland et leurs collègues ont décrit leur travail dans le numéro du 24 juin de Communication Nature .

La méthode repose sur une analyse minutieuse des images de particules fluorescentes que les chercheurs ont déposées sur des plaquettes de silicium plates pour l'étalonnage de leur microscope. En raison des aberrations de l'objectif, au fur et à mesure que le microscope se déplaçait de haut en bas par incréments spécifiques le long de l'axe vertical - la troisième dimension - les images semblaient déséquilibrées et les formes et les positions des particules semblaient changer. Les chercheurs du NIST ont découvert que les aberrations peuvent produire de grandes distorsions dans les images même si le microscope se déplace de quelques micromètres (millionièmes de mètre) dans le plan latéral ou de quelques dizaines de nanomètres dans la dimension verticale.

L'analyse a permis aux chercheurs de modéliser exactement comment les aberrations de la lentille ont modifié l'apparence et l'emplacement apparent des particules fluorescentes avec des changements dans la position verticale. En calibrant soigneusement l'apparence changeante et l'emplacement apparent d'une particule à sa position verticale, l'équipe a réussi à utiliser le microscope pour mesurer avec précision les positions dans les trois dimensions.

« Contre-intuitivement, les aberrations de l'objectif limitent la précision en deux dimensions et permettent une précision en trois dimensions, " dit Stavis. " De cette façon, notre étude change la perspective de la dimensionnalité des images au microscope optique, et révèle le potentiel des microscopes ordinaires à faire des mesures extraordinaires. »

L'utilisation des informations latentes fournies par les aberrations optiques complète les méthodes moins accessibles que les microscopistes utilisent actuellement pour effectuer des mesures dans la troisième dimension, Stavis a noté. La nouvelle méthode a le potentiel d'élargir la disponibilité de telles mesures.

Les scientifiques ont testé leur méthode d'étalonnage en utilisant le microscope pour imager une constellation de particules fluorescentes déposées au hasard sur un engrenage en silicium microscopique qui tournait dans les trois dimensions. Les chercheurs ont montré que leur modèle corrigeait avec précision les aberrations de l'objectif, permettant au microscope de fournir des informations tridimensionnelles complètes sur la position des particules.

Les chercheurs ont ensuite pu étendre leurs mesures de position pour capturer toute la plage de mouvement de l'engin, y compris sa rotation, vacillant et se balançant, terminer l'extraction des informations spatiales du système. Ces nouvelles mesures ont mis en évidence les conséquences des écarts nanométriques entre les parties du microsystème, qui variait en raison d'imperfections dans la fabrication du système. Tout comme un roulement desserré sur une roue la fait vaciller, l'étude a montré que les écarts nanométriques entre les pièces dégradaient non seulement la précision de la rotation intentionnelle, mais aussi causé des oscillations involontaires, basculement et même flexion de l'engin, tout cela pourrait limiter ses performances et sa fiabilité.

Les laboratoires de microscopie pourraient facilement mettre en œuvre la nouvelle méthode, dit Copeland. "L'utilisateur a juste besoin d'un échantillon standard pour mesurer leurs effets et d'un étalonnage pour utiliser les données résultantes, " a ajouté Stavis. En plus des particules fluorescentes ou d'un standard similaire, qui existent déjà ou émergent, aucun équipement supplémentaire n'est nécessaire. Le nouvel article de revue comprend un logiciel de démonstration qui guide les chercheurs sur la manière d'appliquer l'étalonnage.