Disposition 2D de 44, 400 chronomètres lumineux permettent une imagerie de durée de vie en fluorescence sans balayage. Crédit :Université de Tokushima
La microscopie à fluorescence est largement utilisée en biochimie et en sciences de la vie car elle permet aux scientifiques d'observer directement les cellules et certains composés à l'intérieur et autour d'elles. Les molécules fluorescentes absorbent la lumière dans une plage de longueurs d'onde spécifique, puis la réémettent dans la plage de longueurs d'onde plus longue. Cependant, la limitation majeure des techniques classiques de microscopie à fluorescence est que les résultats sont très difficiles à évaluer quantitativement; l'intensité de fluorescence est significativement affectée à la fois par les conditions expérimentales et par la concentration de la substance fluorescente. Maintenant, une nouvelle étude menée par des scientifiques japonais est sur le point de révolutionner le domaine de la microscopie à fluorescence à vie.
Un moyen de contourner le problème conventionnel consiste à se concentrer sur la durée de vie de la fluorescence plutôt que sur l'intensité. Lorsqu'une substance fluorescente est irradiée avec un court éclat de lumière, la fluorescence résultante ne disparaît pas immédiatement mais "se désintègre" au fil du temps d'une manière spécifique à cette substance. La technique de microscopie à durée de vie en fluorescence exploite ce phénomène, indépendante des conditions expérimentales, quantifier les molécules fluorescentes et les modifications de leur environnement. Cependant, la décroissance de la fluorescence est extrêmement rapide, et les caméras ordinaires ne peuvent pas le capturer. Alors qu'un photodétecteur à point unique peut être utilisé à la place, il doit être balayé dans toute la zone de l'échantillon pour pouvoir reconstruire une image 2D complète à partir de chaque point mesuré. Ce processus implique le mouvement de pièces mécaniques, ce qui limite grandement la vitesse de capture d'image.
Dans cette étude récente, Publié dans Avancées scientifiques , l'équipe de scientifiques a développé une nouvelle approche pour acquérir des images de fluorescence à vie sans avoir besoin d'un balayage mécanique. Professeur Takeshi Yasui, de l'Institut de photonique post-LED (pLED), Université de Tokushima, Japon, qui a dirigé l'étude, dit, "Notre méthode peut être interprétée comme une cartographie simultanée de 44, 400 « chronomètres » basés sur la lumière sur un espace 2D pour mesurer les durées de vie de la fluorescence, le tout en un seul coup et sans balayage. »
Cette nouvelle technique de microscopie à fluorescence mesurera à la fois l'intensité et la durée de vie de la fluorescence et ne nécessitera pas de balayage mécanique d'un point focal; au lieu, il produira des images de tous les points de l'échantillon simultanément, permettant une étude plus quantitative des processus biologiques et chimiques dynamiques. Crédit : Suana Science YMY
L'un des principaux piliers de leur méthode est l'utilisation d'un peigne de fréquence optique comme lumière d'excitation de l'échantillon. Un peigne de fréquence optique est essentiellement un signal lumineux composé de la somme de nombreuses fréquences optiques discrètes avec un espacement constant entre elles. Le mot « peigne » dans ce contexte fait référence à l'apparence du signal lorsqu'il est tracé par rapport à la fréquence optique :un groupe dense de pointes équidistantes s'élevant à partir de l'axe de fréquence optique et ressemblant à un peigne à cheveux. En utilisant un équipement optique spécial, une paire de signaux de peigne de fréquence d'excitation est décomposée en signaux de battement optiques individuels (battements optiques à double peigne) avec différentes fréquences de modulation d'intensité, chacun portant une fréquence de modulation unique et irradié sur l'échantillon cible. La clé ici est que chaque faisceau lumineux frappe l'échantillon sur un emplacement spatialement distinct, créer une correspondance un à un entre chaque point sur la surface 2-D de l'échantillon (pixel) et chaque fréquence de modulation des battements optiques à double peigne.
En raison de ses propriétés de fluorescence, l'échantillon réémet une partie du rayonnement capté tout en préservant la correspondance fréquence-position. La fluorescence émise par l'échantillon est ensuite simplement focalisée à l'aide d'une lentille sur un photodétecteur monopoint à grande vitesse. Finalement, le signal mesuré est transformé mathématiquement dans le domaine fréquentiel, et la durée de vie de fluorescence à chaque "pixel" est facilement calculée à partir du retard de phase relatif qui existe entre le signal d'excitation à cette fréquence de modulation par rapport à celui mesuré.
Grâce à sa vitesse supérieure et sa haute résolution spatiale, la méthode de microscopie développée dans cette étude permettra d'exploiter plus facilement les avantages des mesures de durée de vie de fluorescence. "Parce que notre technique ne nécessite pas de numérisation, une mesure simultanée sur l'ensemble de l'échantillon est garantie à chaque tir, " dit le professeur Yasui, "Cela sera utile dans les sciences de la vie où des observations dynamiques de cellules vivantes sont nécessaires." En plus de fournir un aperçu plus approfondi des processus biologiques, cette nouvelle approche pourrait être utilisée pour l'imagerie simultanée de plusieurs échantillons pour le test d'antigène, qui est déjà utilisé pour le diagnostic de COVID-19.
Peut-être le plus important, cette étude montre comment les peignes de fréquence optique, qui n'étaient utilisées que comme "règles de fréquence, " peut trouver une place dans les techniques de microscopie pour repousser les limites des sciences de la vie. Il est prometteur pour le développement de nouvelles options thérapeutiques pour traiter les maladies incurables et augmenter l'espérance de vie, profitant ainsi à l'ensemble de l'humanité.
