Un effort de collaboration majeur qui s'est développé au cours des trois dernières années entre l'ASU et les scientifiques européens, a entraîné une avancée technique significative dans les stratégies d'échantillons cristallographiques aux rayons X.

La contribution de l'ASU provient de la School of Molecular Sciences (SMS), département de physique et le Biodesign Institute Center for Applied Structural Discovery.

Le laser européen à électrons libres de rayons X (EuXFEL) est un centre de recherche de superlatifs :il génère des impulsions de rayons X ultracourtes—27, 000 fois par seconde et avec une brillance un milliard de fois supérieure à celle des meilleures sources de rayonnement X conventionnelles. Après dix ans de construction, il a ouvert ses portes aux premières expérimentations fin 2017. Le groupe d'Alexandra Ros, Le professeur du SMS de l'ASU s'est vu attribuer la deuxième attribution de temps de faisceau parmi les concurrents mondiaux.

leurs résultats, publié le 9 septembre dans Communication Nature , a validé un générateur de gouttelettes microfluidique unique pour réduire la taille des échantillons ainsi que les déchets (qui peuvent atteindre 99 %) dans les expériences de cristallographie femtoseconde en série (SFX) de son équipe. En utilisant ceci, ils ont déterminé la structure cristalline de l'enzyme 3-Deoxy-d-manno-Octulosonate 8-Phosphate Synthase (KDO8PS) et ont révélé de nouveaux détails dans une région de boucle non définie de l'enzyme qui est une cible potentielle pour les études d'antibiotiques.

"Nous sommes ravis que ce travail, résultant d'un énorme effort de collaboration, a été bien reçu dans la communauté XFEL, " a expliqué Ros. " Nous développons davantage cette méthode et cherchons à synchroniser les gouttelettes microfluidiques avec les impulsions des XFEL. À ce moment précis, une petite équipe d'étudiants de l'ASU vient de terminer des expériences à la source de lumière cohérente Linac (LCLS) au SLAC National Accelerator Laboratory à Menlo Park, CA pour affiner la méthode. Il n'aurait pas pu y avoir de meilleur timing pour la publication de notre travail."

Le SLAC a été l'installation XFEL la plus connue des scientifiques américains où les travaux désormais célèbres sur la cristallographie des nanocristaux de protéines (par l'équipe ASU dirigée par les professeurs John Spence et Petra Fromme) ont été réalisés. SLAC et son compagnon en Europe, aussi à Hambourg, ont eu beaucoup de succès et par conséquent, sont devenus fortement surbookés. La mise en service de la nouvelle installation, avec son tunnel d'accélérateur géant de 2,6 milles et sa résolution à l'échelle de la longueur atomique, a allégé une partie de la demande sur les autres installations, tout en offrant de nouvelles possibilités grandioses dans les sciences physiques.

SFX est une technique prometteuse pour la détermination de la structure des protéines, où un flux liquide contenant des cristaux de protéines est croisé avec un faisceau XFEL à haute intensité qui est un milliard de fois plus lumineux que les sources de rayons X synchrotron traditionnelles.

Bien que les cristaux soient détruits par le faisceau XFEL intense immédiatement après avoir été diffractés, les informations de diffraction peuvent, remarquablement, encore être enregistrées grâce aux détecteurs de pointe. De nouvelles méthodes puissantes d'analyse de données ont été développées, permettant à une équipe d'analyser ces schémas de diffraction et d'obtenir des cartes de densité électronique et des informations structurelles détaillées sur les protéines.

La méthode est particulièrement intéressante pour les protéines difficiles à cristalliser, comme les protéines membranaires, car il fournit des informations structurelles à haute résolution à partir de micro et même de nanocristaux, réduisant ainsi la contribution des défauts cristallins et évitant la croissance fastidieuse (voire impossible) des gros cristaux exigée par la cristallographie synchrotron traditionnelle.

Alors que la cristallographie avec XFELs a été une technique puissante pour démêler les structures de grands complexes protéiques et permettre également la cristallographie résolue en temps, cette science de pointe engendre néanmoins un problème majeur. En raison du faible taux de "hit", il nécessite d'énormes quantités de protéines en suspension, qui, bien que non irradié, sont difficiles à récupérer pour la plupart des échantillons de protéines. Jusqu'à 99% des protéines peuvent être gaspillées.

C'est là que réside l'avancée technique majeure de Ros et de son équipe. Ils ont développé un dispositif microfluidique imprimé en 3D, qui est à haute résolution, et génère des gouttelettes aqueuses dans l'huile de segmentation de gouttelettes variable qui peuvent être synchronisées avec les impulsions laser à électrons libres. Cela réduit considérablement la quantité de protéine purifiée nécessaire pour l'expérience européenne XFEL par rapport à l'exigence actuellement typique (et presque inaccessible) de 1 g pour l'enregistrement de l'ensemble de données complet.

L'importance de cette évolution mérite d'être rappelée. L'approche des chercheurs entrelace des "slugs" liquides chargés d'échantillons dans un liquide sacrificiel, de sorte qu'un microjet de liquide rapide est maintenu avec l'échantillon présent uniquement pendant l'exposition aux impulsions femtosecondes XFEL (durée d'un millionième d'un milliardième de seconde).

L'équipe de scientifiques a démontré la génération de gouttelettes des suspensions cristallines de l'enzyme KDO8PS avec le générateur de gouttelettes microfluidique et a montré que la fréquence de génération de gouttelettes peut être contrôlée par les débits des flux aqueux et pétroliers. La qualité de diffraction des cristaux de KDO8PS est similaire à la fois lorsqu'ils sont injectés dans des gouttelettes aqueuses entourées d'huile ou par injection continue avec un Gas Dynamic Virtual Nozzle (GDVN), avec une réduction d'environ 60 % de la consommation d'échantillons obtenue grâce à l'injection de gouttelettes.

La structure déterminée a révélé de nouveaux détails dans une région de boucle précédemment non définie de KDO8PS, une cible potentielle pour les études d'antibiotiques. Ces résultats plaident en faveur d'une future intégration de routine de la génération de gouttelettes par flux d'huile segmenté dans d'autres XFEL dans le monde.