Une nouvelle technique développée par des chercheurs du Centre d'excellence de l'ARC pour la biophotonique à l'échelle nanométrique (CNBP) aidera à éclairer les questions biologiques en améliorant la qualité et la quantité d'informations pouvant être extraites en microscopie à fluorescence.

La technique, La « microscopie multicanal assistée par blanchiment » (BAMM) prend une faiblesse actuelle de longue date de la microscopie à fluorescence - le photoblanchiment - et la transforme en une force qui améliore la sortie d'imagerie jusqu'à trois fois, sans matériel supplémentaire requis.

Rapporté dans le journal Optique Biomédicale Express , BAMM aidera les chercheurs à mieux comprendre les processus complexes qui se déroulent dans les cellules vivantes. Cela inclut l'interaction entre les protéines et les molécules qui ont le potentiel d'avoir un impact sur un large éventail de domaines de la santé de la fertilité, à la douleur, aux maladies cardiaques et plus encore.

"La microscopie à fluorescence est l'une des techniques les plus utilisées en biologie. C'est là que des molécules émettant de la lumière appelées fluorophores sont liées à des cibles cellulaires extrêmement petites telles que des protéines, matériel génétique ou autres biomolécules d'intérêt, " dit le Dr Antony Orth, Chercheur CNBP à l'Université RMIT et auteur principal du document de recherche.

"Lorsque le fluorophore est excité par la lumière du microscope, il réagit en émettant une signature de couleur spécifique. Voir cette signature de couleur au microscope nous aide à voir, suivre et comprendre la cible cellulaire à laquelle le fluorophore a été lié."

Notamment, dit le Dr Orth, vous pouvez attacher des fluorophores de couleurs différentes à différentes cibles cellulaires, le tout dans un seul échantillon, pour maximiser les données et les informations d'imagerie reçues.

Cette approche traditionnelle de la microscopie à fluorescence est polyvalente, mais il y a une limitation majeure :le spectre visible (ou couleur), où la plupart des fluorophores opèrent, peut être encombré. Dans une expérience idéale, chaque cible doit être choisie pour avoir une émission de couleur distincte, mais cela devient de plus en plus difficile à organiser à mesure que le nombre de cibles augmente.

"Le spectre des couleurs visibles s'étend sur une plage de 400 nanomètres (nm) à 700 nm et seulement environ 200 nm de cette plage sont disponibles pour l'émission de couleur de fluorescence, " explique le Dr Orth.

"Un fluorophore typique émet sur une plage de 50 nm du spectre de couleurs. Diviser 200 nm du spectre visible en segments de 50 nm signifie que les couleurs des émetteurs fluorescents commencent à se mélanger lorsque vous essayez de presser plus de quatre couleurs. "

« Cela limite généralement les chercheurs à quatre cibles fluorescentes ou moins dans un échantillon, " dit le Dr Orth.

"Typiquement, la plupart des expériences sont encore moins ambitieuses, incorporant seulement deux ou trois cibles. Le cœur du problème est qu'une seule propriété du fluorophore - sa couleur - est utilisée pour l'identification."

Pour aider à surmonter cette limitation, Le Dr Orth et ses co-chercheurs ont mis au point une technique innovante appelée « microscopie multicanaux assistée par blanchiment » (BAMM) pour augmenter leur rendement d'imagerie.

"Au lieu d'utiliser la couleur pour différencier les fluorophores, nous utilisons la quatrième dimension du temps et exploitons un phénomène appelé photoblanchiment - la gradation d'une collection de fluorophores ou de pigments sous une exposition répétée à la lumière, " dit le Dr Orth.

"Parce que chaque type de photo-blanchiment fluorophore à un rythme différent, nous pouvons différencier les fluorophores sans utiliser aucune information de couleur. Nous utilisons le taux de photoblanchiment comme identifiant."

"Lorsqu'il est associé à des informations de couleur traditionnelles, cette dimension supplémentaire de photo-blanchiment permet aux scientifiques d'utiliser 2 à 3 fois plus de types de molécules fluorescentes, le tout dans un seul échantillon. Cela nous permet d'extraire beaucoup plus d'informations à partir d'une seule enquête."

"Les chercheurs pourront concevoir des tests plus informatifs - par exemple, mettant en évidence cinq cibles alors que deux seulement étaient auparavant réalisables. Ils n'auront plus à éviter d'utiliser deux fluorophores de même couleur, puisqu'une différence de photostabilité suffit à elle seule pour distinguer les deux cibles, " il dit.

Traditionnellement, le phénomène de photoblanchiment (ou décoloration) a été préjudiciable au processus de microscopie à fluorescence. C'est là que l'éclairage à haute intensité et continu du microscope détruit de manière permanente la capacité d'un fluorophore à devenir fluorescent, de sorte que l'imagerie de la cible cellulaire devient impossible.

"BAMM transforme le photoblanchiment d'une faiblesse de longue date de la microscopie à fluorescence en une force significative pour permettre une identification accrue des cibles cellulaires, " dit le Dr Orth.

"BAMM ne nécessite aucun matériel supplémentaire, c'est relativement simple à faire et ne nécessite aucune préparation d'échantillon spécialisée. C'est une nouvelle approche extrêmement excitante qui a le potentiel de bénéficier à tous les utilisateurs de microscopie à fluorescence et à leur science exploratoire, " il dit.

Les chercheurs officiellement impliqués dans le projet BAMM étaient affiliés au CNBP (Université RMIT et Université d'Adélaïde) et à Thermo Fisher Scientific.