PB430 se compose d'un squelette €-conjugué entièrement fusionné avec une unité phosphole P-oxyde acceptant les électrons, qui est responsable de sa haute photostabilité. L'acide carboxylique de la molécule peut être converti en l'ester N-hydroxylsuccinimidyle (NHS), qui permet la conjugaison à des biomolécules. Les groupes sulfonate assurent une solubilité élevée de la molécule dans l'eau. Crédit :ITbM, Université de Nagoya
Chimistes à l'ITbM, L'Université de Nagoya a développé un colorant fluorescent super-photostable appelé PhoxBright 430 (PB430) pour visualiser l'ultrastructure cellulaire par microscopie à super-résolution. La photostabilité exceptionnelle de ce nouveau colorant permet une imagerie STED continue. Grâce à sa capacité à marquer les protéines avec des marqueurs fluorescents, PB430 démontre son utilisation dans la construction 3-D et l'imagerie multicolore de structures biologiques.
Microscopie à fluorescence super-résolution, qui a reçu le prix Nobel de chimie 2014, permet aux chercheurs de visualiser les systèmes biologiques et d'acquérir une compréhension détaillée de la dynamique complexe des biomolécules. En particulier, La microscopie à déplétion par émission stimulée (STED) est largement utilisée pour examiner les processus dans les systèmes vivants en raison de sa vitesse d'acquisition rapide et de sa compatibilité avec de nombreux échantillons biologiques.
Des chimistes de l'Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM) de l'Université de Nagoya ont développé un nouveau colorant fluorescent photostable, PhoxBright 430 (PB430), qui permet une imagerie STED continue à super-résolution de cellules marquées par fluorescence. Comme PB430 contient une fraction fonctionnelle pour permettre la conjugaison avec un anticorps, des cibles biomoléculaires spécifiques à l'intérieur d'une cellule peuvent être colorées par immunofluorescence. La photostabilité exceptionnelle du PB430 a permis aux chercheurs de construire une image STED 3-D de microtubules cellulaires et d'obtenir une imagerie STED multicolore de cytosquelettes immunomarqués fluorescents en combinant le PB430 photostable et des colorants disponibles dans le commerce.
Les propriétés uniques du PB430 en font un outil puissant pour révéler les structures et les fonctions des cellules, et pourrait être appliqué à la visualisation prolongée du mouvement des organites et des molécules à l'intérieur des cellules. Les résultats de cette étude ont été récemment publiés dans le Journal de l'American Chemical Society .
Afin d'atteindre une haute résolution en microscopie STED, un échantillon biologique marqué avec un fluorophore (un colorant fluorescent utilisé pour marquer des échantillons biologiques tels que des protéines, tissus et cellules) est irradié avec un faisceau d'excitation de fluorescence avec un faisceau STED en forme de beignet pour supprimer l'excitation des molécules environnantes. Bien que ce soit une technique puissante, le besoin d'un faisceau STED à haute intensité, qui provoque le photoblanchiment des colorants, a inhibé l'utilisation pratique de la microscopie STED dans l'imagerie continue des cellules vivantes.
Les chercheurs ont déjà signalé un colorant fluorescent, C-Naphox, qui présente une forte photostabilité en imagerie STED. Le groupe a maintenant optimisé la structure du C-Naphox et développé le nouveau colorant fluorescent photostable, qui peut être utilisé pour la visualisation des structures à l'intérieur des cellules.
PB430 montre une photostabilité exceptionnelle par rapport aux colorants conventionnels, comme le montre le nombre d'images confocales qui peuvent être prises sans perdre son intensité de fluorescence relative. Le nouveau colorant peut également marquer des protéines, tels que des anticorps et est capable de balayer la cellule le long de l'axe z avec un pas de 50 nm, résultant en la reconstruction de l'image 3D-STED du cytosquelette avec une résolution sur l'axe z de 160 nm. Crédit :ITbM, Université de Nagoya
"C-Naphox s'est avéré être un colorant extrêmement photostable pour l'imagerie STED de divers matériaux, nous avons donc décidé d'affiner davantage ses propriétés et de l'appliquer pour visualiser des ultra-structures, " dit Masayasu Taki, professeur agrégé à l'ITbM et l'un des leaders de cette recherche. "Notre nouvelle teinture, PB430 montre une solubilité accrue dans l'eau, fluorescent efficacement dans les milieux aqueux, et est capable de marquer des anticorps. Nous avons été ravis d'observer qu'il présente également une photostabilité élevée dans des conditions STED, " dit Taki.
Chenguang Wang, chercheur postdoctoral dans le groupe de recherche du professeur Shigehiro Yamaguchi à l'ITbM, synthétisé PB430 et réalisé les expériences d'imagerie STED. De la même manière que C-Naphox, le nouveau colorant fluorescent est stable à l'air et se compose d'une structure renforcée, anneau fusionné, Squelette π-conjugué qui contient une unité phosphole P-oxyde, qui est à l'origine du nom PhoxBright. Au lieu de la fraction triphénylamine, Le PB430 possède un groupe acide carboxylique qui peut se conjuguer à des anticorps pour un immunomarquage via la formation d'un ester N-hydroxylsuccinimidyle (NHS).
Des expériences d'imagerie STED d'anticorps conjugués à PB430 dans des cellules HeLa fixées ont conduit à des images de fluorescence de microtubules immunomarqués, avec seulement un léger photoblanchiment. PB430 a agi comme un marqueur fluorescent pour les protéines et son intensité de fluorescence a été maintenue même lorsqu'il a été conjugué.
"La photostabilité élevée du PB430 permet une imagerie par fluorescence qui n'était pas facilement possible avec les colorants conventionnels, " explique Taki. " Par exemple, PB430 peut être utilisé dans l'imagerie 3-D-STED du cytosquelette, car il peut supporter le faisceau STED continu sur l'axe z après l'imagerie sur l'axe xy."
Par ailleurs, le groupe a montré que le PB430 pouvait être appliqué à l'imagerie STED multicolore en tirant parti de la différence de photostabilité entre divers colorants fluorescents. Ils ont réalisé des expériences d'imagerie STED des microtubules et de la vimentine (protéines des filaments intermédiaires) du cytosquelette, immunomarqué avec PB430 et Alexa Fluor 430 (un colorant fluorescent), respectivement. Alors qu'Alexa Fluor 430 blanchit après avoir pris la première image STED, la deuxième image ne montre que des microtubules marqués au PB430. La soustraction de la première image de la deuxième image révèle les filaments de vimentine marqués Alexa Fluor 430.
"D'habitude, l'imagerie STED multicolore nécessite plusieurs lasers d'excitation et un seul faisceau laser STED, mais dans la combinaison d'Alexa Fluor 430 avec PB430, nous n'avons besoin que d'une seule paire de lasers d'excitation et STED, " explique Taki. " En utilisant PB430, nous pensons qu'il sera possible de réaliser une imagerie STED multicolore avec un certain nombre de combinaisons différentes de divers colorants fluorescents. L'étape suivante consiste à améliorer la perméabilité de la membrane cellulaire du colorant afin de visualiser les fonctions de nombreuses autres structures cellulaires, " il continue.
"Nos recherches ont montré que la forte photostabilité et la compatibilité physiologique du PB430 permettent une imagerie répétée ainsi que l'imagerie 3D et l'imagerie multicolore des cellules par microscopie STED, " dit Yamaguchi. " Nous espérons que nous pourrons appliquer notre colorant fluorescent pour l'imagerie prolongée de cellules vivantes par microscopie STED et microscopie à molécule unique, afin d'examiner divers processus biologiques.
