Le diagnostic moléculaire joue un rôle de plus en plus important en médecine pour la détection des maladies génétiques, le suivi de l'efficacité des thérapies anticancéreuses, et dans la lutte contre les infections bactériennes agressives. Diagnostic de curiosité (CD), une société appartenant au groupe Scope Fluidics, a développé une nouvelle technique d'analyse de l'ADN :la PCR synergique (sPCR). La méthode, décrit en détail dans la publication conjointe des chercheurs CD et IPC PAS en Rapports scientifiques combine les avantages de deux des techniques d'analyse du code génétique les plus populaires d'aujourd'hui et peut être effectuée sur des instruments largement disponibles.

"La technique de dosage ADN que nous proposons est née lors du développement de l'instrument analytique innovant PCR|ONE, qui peut être utilisé pour tester le code génétique en seulement sept minutes. C'est un temps plus de dix fois plus court que ce qui est requis dans les solutions classiques, " déclare le Pr Piotr Garstecki (IPC PAS, CD).

Les échantillons envoyés pour les analyses d'ADN contiennent généralement si peu de matériel génétique que leur analyse par des techniques de laboratoire conventionnelles ne serait pas possible. Après avoir éliminé les impuretés de l'échantillon, la première étape consiste à augmenter la quantité de matériel génétique, souvent jusqu'à un milliard de fois. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée à cette fin.

La réaction PCR implique le chauffage et le refroidissement cycliques d'une solution contenant le matériel génétique à amplifier et les réactifs appropriés :une polymérase (c'est-à-dire l'enzyme catalysant la réaction de synthèse de l'ADN), les nucléotides nécessaires à la construction du brin d'ADN, et amorces, c'est à dire., de courts fragments d'ADN capables de se fixer au début et à la fin du fragment de code propagé (par exemple, un gène spécifique). Chaque cycle PCR comprend des phases de chauffage et de refroidissement. Dans la première phase, à une température d'environ 95 degrés centigrades, les ponts hydrogène se brisent, et la chaîne d'ADN jusqu'à présent double brin se scinde en deux brins simples. Dans la phase froide, à une température d'environ 50 degrés, les amorces de la solution se fixent aux sites correspondants sur les fils, après quoi la polymérase construit un fil complémentaire entre eux. A la fin de chaque cycle, il y a (dans des conditions idéales) deux fois plus de fragments d'ADN double brin qu'au début.

La PCR est utilisée pour détecter des fragments spécifiques du code génétique et pour estimer la quantité originale de matériel génétique. Les mesures quantitatives sont généralement effectuées à l'aide d'une technique analogique connue sous le nom de PCR en temps réel. L'échantillon est propagé, et dans les cycles suivants, la quantité d'ADN est vérifiée à l'aide de colorants fluorescents. Lorsque l'intensité des changements dépasse un seuil défini, la quantité originale de matériel génétique est estimée sur la base du nombre de cycles. La technique PCR analogique est relativement simple, mais en raison de la sensibilité de la PCR à même des particules simples d'impuretés, cela demande de la prudence, étalonnage continu.

Une autre méthode est la PCR numérique. L'échantillon est divisé en dizaines ou centaines de milliers, et parfois même des millions de partitions de volume égal. Puis, dans chaque partition, la procédure de duplication du matériel génétique est effectuée et des contrôles sont effectués si le changement défini apparaît. Lors de la division de l'échantillon d'ADN, les molécules n'atteignent que certaines partitions, le changement ne se produit donc pas partout. La quantité originale d'ADN peut donc être estimée sur la base du nombre de signaux enregistrés. L'avantage de la technologie numérique est qu'il n'y a pas besoin de calibrer l'appareil. Cependant, en raison de la nécessité de conduire un grand nombre de réactions en parallèle, l'équipement de test est coûteux et n'est pas aussi courant dans les laboratoires que les appareils PCR analogiques.

PCR synergique, la technique proposée par CD et IPC PAS, combine les avantages les plus importants des méthodes analogiques et numériques. Pour obtenir des mesures fiables, il suffit de diluer un échantillon en une douzaine seulement, ou au plus plusieurs dizaines de partitions. Cette méthode ne nécessite pas d'étalonnage.

"Un petit nombre de partitions, caractéristique de notre technique, revêt une importance pratique particulière. Cela signifie que pour effectuer l'analyse, tout ce qui est nécessaire est le format de plaque à puits standard utilisé dans les appareils PCR analogiques courants, " dit Pawel Debski, un doctorant IPC PAS, qui a développé la méthode sPCR chez Curiosity Diagnostics.

En raison du petit nombre d'échantillons de partitions, la technique sPCR est plus facile à réaliser et légèrement plus rapide que les variantes numériques. Par rapport aux techniques analogiques, cependant, plus de réactifs sont nécessaires. Pour cette raison, il ne remplacera pas la variante analogique, selon les scientifiques. Cependant, il peut être un complément précieux car il ne nécessite aucun étalonnage, permettant ainsi au personnel du laboratoire de vérifier indépendamment l'exactitude des mesures analogiques.

"Notre technique de test ADN a été brevetée. Cependant, nous voulons souligner la liberté de l'utiliser à des fins non commerciales. Et comme il utilise typique, équipement de test génétique populaire, tout ce que vous avez à faire pour commencer est de consulter notre article, " souligne le Pr Garstecki.

Dans les machines PCR standard, une diffusion de chaleur relativement lente entre l'échantillon et un grand bloc adjacent de matériau alternativement chauffé ou refroidi est utilisée pour chauffer et refroidir le matériel génétique. Dans PCR|ONE, le rayonnement infrarouge est utilisé pour chauffer l'échantillon rapidement. Le mécanisme de refroidissement par diffusion a également été modifié :le bloc utilisé à cet effet est plus petit que dans les instruments conventionnels et il est maintenu à une constante, température strictement contrôlée. Grâce aux améliorations techniques et analytiques, les prototypes de PCR|ONE sont capables de réaliser des dosages ADN en moins d'un quart d'heure, et le PCR lui-même ne prend que sept minutes. Les premiers appareils PCR|ONE arriveront probablement sur le marché dans deux à trois ans.