Dans l'électrophorèse sur gel, des échantillons d'ADN ou de protéines sont séparés - généralement en fonction de leur taille - en appliquant un champ électrique qui les fait migrer à travers un gel. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel est courante dans les laboratoires de recherche biomédicale et est utilisée pour répondre à une variété de questions différentes, il n'y a donc pas vraiment de façon universelle d'analyser les résultats. Différentes techniques telles que le transfert Western, le transfert Northern et le transfert Southern, par exemple, impliquent toutes une électrophorèse sur gel. Si vous faites l'électrophorèse sur gel d'agarose d'échantillons d'ADN, le type de procédure le plus courant, vous devrez généralement faire au moins deux choses: 1) distinguer les plasmides non coupés des inserts, des plasmides coupés et des plasmides coupés et 2) estimer la taille des divers fragments d'ADN. Voici comment cela fonctionne.
Vérifiez votre bloc-notes de laboratoire pour déterminer quels échantillons ont été chargés dans quelles voies. Lorsque vous avez chargé les puits pour votre gel, vous devriez avoir noté l'identité de chaque voie /échantillon.
Déterminer quelle voie contient «l'échelle» des étalons d'ADN. Ce sont des fragments de longueur connue; leur distance de migration peut être utilisée pour déterminer la taille des fragments d'échantillon.
En utilisant une règle, mesurez la distance sur votre image des puits au colorant de suivi, qui aura voyagé plus loin que n'importe quelle bande d'ADN. (en d'autres termes, ce sera au bas du gel). Notez ce nombre - les unités que vous utilisez ne sont pas importantes.
Mesurez la distance sur votre image depuis les puits jusqu'à chacune des bandes de «l'échelle», puis divisez cette distance par la distance parcourue par le suivi de bande de colorant. Ce calcul vous donne la mobilité relative de chaque bande.
Exemple: Supposons que la bande de colorant de suivi a parcouru 6 pouces et que nous avons trois bandes qui ont parcouru 5, 4,5 et 3,5 pouces. Quelle est leur mobilité relative? Réponse: Nous divisons 5, 4,5 et 3,5 par 6 pour obtenir des mobilités relatives de 0,833, 0,75 et 0,5833.
Entrez les mobilités relatives dans votre tableur (Excel ou tout autre programme similaire que vous utilisez) avec le taille en kilobases de chaque fragment de l'échelle. (Le fabricant vous donne la taille de chaque fragment dans les échelles qu'ils fournissent, donc vous devriez déjà avoir cette information.)
Tracez les données avec une mobilité relative sur le x et la taille en kilobases sur le y.
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Utilisez la fonction Trendline de votre tableur pour ajuster une équation aux données. Cette équation devrait être une équation de puissance (par exemple x ^ -2) et devrait correspondre relativement bien aux données (coefficient R d'au moins 0,9).
Regardez les bandes correspondant à vos échantillons. Rappelez-vous que les fragments d'ADN plus petits voyagent plus loin à travers le gel que les fragments d'ADN de grande taille, de sorte que ceux qui sont les plus proches du colorant de suivi seront les plus petits. Notez, cependant, que si l'ADN plasmidique (circulaire) n'est pas coupé, il deviendra "super-enroulé" ou tordu comme un cordon téléphonique, ce qui le fera réellement voyager plus loin que l'ADN linéaire de la même taille. De même, un plasmide "coupé" qui a été incomplètement coupé parcourra une distance plus courte que l'ADN linéaire de la même taille. Par conséquent, vous ne pouvez pas estimer la taille des plasmides non coupés à partir de votre gel.
Faites correspondre les bandes dans chaque voie avec l'identité de l'échantillon que vous avez chargé dans cette voie et déterminez si vous voyez ce que vous attendiez . Cela dépendra de la nature de votre expérience. En général, cependant, si vous avez digéré un plasmide d'insertion avec deux enzymes de restriction, vous vous attendriez à ce que l'insert soit libéré du plasmide; comme il est beaucoup plus petit que le plasmide, on s'attendrait à voir deux bandes dans cette voie, l'une près du sommet et l'autre près du fond. Un plasmide coupé avec une seule enzyme de restriction ne doit former qu'une seule bande qui se déplace un peu plus loin que le plasmide coupé avec deux enzymes de restriction, mais nulle part aussi loin que l'insert.
Mesurer la distance entre les puits le plasmide coupé et insérer des bandes avec votre règle. Divisez ces nombres par la distance parcourue par le colorant de suivi pour trouver la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés.
Insérez la mobilité relative des inserts et des plasmides coupés dans l'équation calculée pour vous par votre tableur. Ce calcul devrait vous donner une estimation de la taille de ces plasmides.
Astuce
Si vous voyez des bandes brillantes et larges dans le bas de chaque voie, vous avez probablement de l'ARN dans votre gel. - votre protocole de purification peut être défectueux.
