Une nouvelle méthode pour améliorer le haut rendement, haute pureté, la purification à haute activité de protéines complexes de 10 à 500 fois a été développée à l'Université d'Alabama à Birmingham.

« Cette nouvelle méthode offre un certain nombre d'avantages cruciaux à la fois aux chercheurs et à l'industrie pharmaceutique, " a déclaré Dmitri Vassylyev, professeur de biochimie et de génétique moléculaire à l'UAB. "C'est potentiellement l'outil le plus efficace et le plus universel pour les études à haut débit de nombreux systèmes biologiques importants et peut aider à la production à grande échelle de protéines thérapeutiques."

Haut rendement, haute pureté, purification à haute activité, ou HHH, est le Saint Graal pour les applications structurelles et industrielles. Le schéma de purification en une seule étape UAB surmonte les faiblesses importantes des systèmes de purification actuels disponibles dans le commerce, dit Vassylyev.

Dans un article publié en Actes de l'Académie nationale des sciences , Vassylyev et ses collègues de l'UAB ont testé leur méthode de purification par chromatographie d'affinité CL7/Im7 sur cinq molécules biologiques traditionnellement difficiles, y compris les protéines membranaires procaryotes et eucaryotes et les protéines de liaison à l'ADN/ARN multi-sous-unités.

"Une illustration notable de la performance supérieure de l'approche CL7/Im7, " ont-ils écrit dans le rapport du PNAS, "est-ce que l'échantillon de protéine CNX, que nous avons purifiés en quelques heures et à partir de quelques grammes seulement de cellules d'E. coli, aurait une valeur marchande d'environ 400 $, 000, selon les prix commerciaux en vigueur.

Le système est simple et réutilisable :les chercheurs de l'UAB ont restauré et réutilisé leur colonne de chromatographie d'affinité plus de 100 fois, maintenant près de 100 pour cent de capacité de liaison.

La méthode est basée sur l'affinité de liaison remarquablement forte entre les toxines bactériennes appelées colicines et leurs protéines immunitaires spécifiques. Une bactérie hôte peut libérer une toxine colicine, telle que la colicine E7 DNAse, capable de tuer d'autres bactéries. A l'intérieur de la bactérie hôte, le CE7 est lié à la protéine immunitaire 7, ou Im7; cette liaison empêche la destruction auto-infligée.

L'affinité de liaison de CE7/Im7 est presque aussi forte qu'une liaison covalente, et il est de quatre à sept ordres de grandeur plus élevé que les autres analogues de chromatographie d'affinité. Vassylyev et ses collègues ont créé une variante inactive de CE7, appelé CL7, qui n'a pas d'activité DNase mais conserve une affinité de liaison totale pour Im7. Ils ont également fabriqué une variante d'Im7 qui permet un couplage efficace avec des billes d'agarose.

En utilisant des techniques génétiques, le tag CL7 s'insère facilement dans les gènes des protéines cibles, chez les eucaryotes et les procaryotes. Ces gènes peuvent être déplacés vers un vecteur d'expression, ou la protéine cible marquée peut être exprimée à partir de cellules natives sans amplification.

Lorsqu'un lysat de protéine brute est versé à travers une colonne remplie de billes d'agarose Im7, les balises CL7 sur la protéine cible se lient à l'Im7. Un site de protéase modifié est utilisé pour libérer la protéine cible de l'étiquette CL7 liée. Cela permet une purification HHH en une étape, avec 97 à 100 pour cent de pureté, pour les protéines cibles testées par les chercheurs de l'UAB.

En revanche, la plupart des schémas de purification publiés pour ces protéines difficiles sont en plusieurs étapes, protocoles sur plusieurs jours, avec des rendements inférieurs. Vassiliev, un cristallographe de protéines, dit que l'obtention de grandes quantités de protéines pures est l'étape limitante de la cristallographie, l'incitant à commencer une recherche d'une meilleure méthode il y a quatre ans.

Les protéines difficiles purifiées dans le rapport PNAS étaient l'ARN polymérase bactérienne de Thermus thermophilus et l'ARN polymérase de Mycobacteria tuberculosis, qui sont des protéines multi-sous-unités ; intégrase membranaire YidC, une protéine membranaire de Bacillus halodurans; calnexine, ou CNX, une protéine chaperon transmembranaire humaine; et deux protéines de liaison aux acides nucléiques, le complexe protéique de condensine multi-sous-unités de Salmonella typhimurium qui replie et compacte l'ADN cellulaire, et le complexe de remodelage humain et de facteur d'espacement, RSF, qui est impliqué dans la médiation de l'assemblage des nucléosomes.

Le système de purification simple est également applicable aux expériences de pulldown et aux essais d'activité cinétique ou de liaison, comme la résonance plasmonique de surface. Il peut également aider la microscopie cryoélectronique.