Les membranes cellulaires sont constituées de phospholipides et de protéines attachées ou incorporées. Les protéines membranaires jouent un rôle vital dans le métabolisme et la vie de la cellule. Vous ne pouvez pas utiliser la microscopie ordinaire pour visualiser ou caractériser les protéines d'adhésion, les protéines de transport et les canaux protéiques dans la membrane cellulaire. L'utilisation de la microscopie électronique et d'une technique appelée «fracture par congélation», qui sépare les membranes des cellules congelées, permet de visualiser la structure de la membrane et l'organisation des protéines dans la mer de phospholipides. La combinaison d'autres méthodes avec la fracturation par congélation nous aide non seulement à comprendre la structure de différentes membranes cellulaires et protéines membranaires, mais permet également de visualiser et d'analyser en détail le fonctionnement de protéines, bactéries et virus spécifiques.
Principales étapes de la fracture de congélation
En utilisant de l'azote liquide, des échantillons de tissus biologiques ou des cellules sont rapidement congelés pour immobiliser les constituants des cellules. Les membranes cellulaires sont composées de deux couches de phospholipides, appelées bicouches, où les queues lipidiques hydrophobes ou détestantes de l'eau pointent vers l'intérieur de la membrane et l'extrémité de la molécule lipidique hydrophile ou épris de l'eau se dirige vers l'intérieur de la cellule. L'échantillon congelé est fissuré ou fracturé avec un microtome, qui est un instrument en forme de couteau pour couper des tranches de tissus minces. Cela provoque la séparation précise de la membrane cellulaire entre les deux couches car l'attraction entre les queues lipidiques hydrophobes représente le point le plus faible. Après la fracturation, l'échantillon subit une procédure sous vide, appelée "gravure sur gel". La surface de l'échantillon fracturé est ombragée de vapeurs de carbone et de platine pour former une réplique stable, qui suit les contours du plan de fracture. L'acide est utilisé pour digérer les matières organiques adhérant à la réplique, laissant une fine coque en platine à la surface de la membrane fracturée. Cette coquille est ensuite analysée par microscopie électronique.
Gravure à froid
La gravure à froid est le séchage sous vide d’un échantillon biologique non fixé, congelé et fracturé à froid. La procédure de séchage sous vide est similaire à la lyophilisation des fruits et légumes emballés et vendus dans les épiceries. Sans attaque au froid, de nombreux détails de la structure cellulaire sont obscurcis par les cristaux de glace. L'étape de gravure profonde ou de gel améliore et étend la méthode originale de fracture par congélation, permettant l'observation des membranes cellulaires au cours de diverses activités. Il permet d'analyser non seulement la structure de la membrane, mais également des composants intracellulaires et fournit des informations structurelles détaillées sur les bactéries, les virus et les grands complexes protéiques cellulaires.
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La microscopie électronique peut révéler et magnifier plus d'un million de fois les organismes ou les structures les plus minuscules, tels que les bactéries, les virus et les composants intracellulaires et même des protéines. La visualisation est créée en bombardant un échantillon ultra-mince avec un faisceau d'électrons. Les deux méthodes de microscopie électronique sont la microscopie électronique à balayage, ou SEM, et la microscopie électronique à transmission, ou TEM. Les échantillons de fracture de congélation sont régulièrement analysés avec la TEM. La résolution du MET est meilleure que celle du SEM et offre des informations structurelles jusqu’à 3 nanomètres de répliques.
Structure de membrane cellulaire révélatrice
Le développement et l’utilisation de la microscopie électronique à fracture congelée ont montré que les membranes plasmiques des cellules sont constituées de bicouches lipidiques et clarifié comment les protéines sont organisées dans les membranes cellulaires. La fracture de congélation donne un aspect unique à l'intérieur des membranes cellulaires, car elle divise et sépare les phospholipides membranaires en deux feuilles ou faces opposées et complémentaires. Depuis plus de 50 ans que la première machine à fracturer par congélation a été introduite, la fabrication d’une réplique en platine demeure le seul moyen d’obtenir des informations structurelles sur la membrane cellulaire. La technique montre si des protéines spécifiques flottent ou sont ancrées dans la membrane cellulaire, et si et comment certaines protéines s'agrègent. Une méthode plus récente, qui utilise des anticorps ciblant des protéines spécifiques, est associée à une fracture par congélation pour identifier les protéines et leur fonction dans la membrane cellulaire.
