Cette image au microscope montre une cellule infectée par le VRS. L'ARN marqué par la sonde est représenté en rouge, tandis que la nucléoprotéine est verte. Crédit :Eric Alonas et Philip Santangelo
Au moment où ils sont deux, la plupart des enfants ont eu le virus respiratoire syncytial (VRS) et ont souffert de symptômes pas pires qu'un mauvais rhume. Mais pour certains enfants, en particulier les bébés prématurés et ceux qui ont des problèmes de santé sous-jacents, Le VRS peut entraîner une pneumonie et une bronchite, qui peuvent nécessiter une hospitalisation et avoir des conséquences à long terme.
Une nouvelle technique pour étudier la structure du virion RSV et l'activité du RSV dans les cellules vivantes pourrait aider les chercheurs à percer les secrets du virus, y compris comment il pénètre dans les cellules, comment il se reproduit, combien de génomes il insère dans ses hôtes - et peut-être pourquoi certaines cellules pulmonaires échappent à l'infection relativement indemnes. Cela pourrait fournir aux scientifiques les informations dont ils ont besoin pour développer de nouveaux médicaments antiviraux et peut-être même un vaccin pour prévenir les infections graves par le VRS.
"Nous voulons développer des outils qui nous permettraient de comprendre comment le virus fonctionne vraiment, " dit Philippe Santangelo, professeur agrégé au département de génie biomédical Wallace H. Coulter de Georgia Tech et de l'Université Emory. "Nous devons vraiment pouvoir suivre l'infection dans une seule cellule vivante sans affecter la façon dont le virus infecte ses hôtes, et cette technologie devrait nous permettre de le faire."
La recherche a été soutenue par l'Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health et publiée en ligne avant impression dans la revue ACS Nano le 30 décembre, 2013. Alors que RSV sera la première cible des travaux, les chercheurs pensent que la technique d'imagerie qu'ils ont développée pourrait être utilisée pour étudier d'autres virus à ARN, y compris la grippe et Ebola.
"Nous avons montré que nous pouvons marquer le génome à l'aide de nos sondes, " a expliqué Santangelo. " Ce que nous avons appris de ceci, c'est que le génome est incorporé dans le virion, et que les particules virales créées sont infectieuses. Nous avons pu caractériser certains aspects de la particule virale elle-même en super-résolution, jusqu'à 20 nanomètres, en utilisant l'imagerie par microscopie à reconstruction optique stochastique directe (dSTORM).
Le VRS peut être difficile à étudier. Pour une chose, la particule infectieuse peut prendre différentes formes, allant de filaments de 10 microns à des sphères ordinaires. Le virus peut insérer plus d'un génome dans les cellules hôtes et l'orientation et la structure de l'ARN sont désordonnées, ce qui rend difficile la caractérisation.
L'équipe de recherche, qui comprenait des scientifiques de l'Université Vanderbilt et de l'Université Emory, utilisé une technologie de sonde qui se fixe rapidement à l'ARN dans les cellules. La sonde utilise plusieurs fluorophores pour indiquer la présence de l'ARN viral, permettant aux chercheurs de voir où il va dans les cellules hôtes - et de regarder les particules infectieuses quitter les cellules pour propager l'infection.
Ce diagramme montre comment la sonde pénètre dans une cellule pour marquer l'ARN viral afin de fournir des informations sur la réplication. Crédit :Eric Alonas et Philip Santangelo
"Être capable de voir le génome et l'ARN de la descendance qui provient du génome avec les sondes que nous utilisons nous donne vraiment beaucoup plus d'informations sur le cycle de réplication, " a déclaré Santangelo. "Cela nous donne beaucoup plus d'informations sur ce que fait réellement le virus. Si nous pouvons visualiser l'entrée, assemblage et réplication du virus, cela nous permettrait de décider quoi faire pour combattre le virus."
La recherche dépendait d'une nouvelle méthode de marquage des virus à ARN à l'aide de sondes d'imagerie à ARN tétravalentes multi-marquées (MTRIPS). Les sondes sont constituées d'une combinaison chimérique d'oligonucléotides d'ADN et d'ARN marqués en interne avec des fluorophores complexés de manière tétravelée à la neutravidine. La combinaison chimérique a été utilisée pour aider les sondes à échapper aux défenses cellulaires.
"Il y a beaucoup de capteurs dans la cellule qui recherchent l'ARN étranger et l'ADN étranger, mais à la cellule, cette sonde ne ressemble à rien, " expliqua Santangelo. " La cellule ne voit pas l'acide nucléique comme étranger. "
Introduit dans les cellules, les sondes diffusent rapidement à travers une cellule infectée par le VRS et se lient à l'ARN du virus. Bien que liant étroitement, la sonde n'affecte pas les activités normales du virus et permet aux chercheurs de suivre l'activité pendant des jours en utilisant des techniques de microscopie standard. Le MTRIPS peut être utilisé pour compléter d'autres technologies de sonde, comme la GFP et les nanoparticules d'or.
Le travail effectué par l'étudiant diplômé Eric Alonas pour concentrer le virus était essentiel au projet, dit Santangelo. La concentration devait se faire sans nuire à l'infectiosité du virus, ce qui aurait eu un impact sur sa capacité à pénétrer dans les cellules hôtes.
"Il a fallu pas mal de travail pour obtenir les bonnes techniques pour concentrer le RSV, ", a-t-il déclaré. "Maintenant, nous pouvons fabriquer beaucoup de virus infectieux qui sont étiquetés et peuvent être stockés afin que nous puissions les utiliser quand nous le voulons."
Pour étudier la progression de l'infection dans des cellules individuelles, les chercheurs ont été confrontés à un autre défi :les cellules vivantes se déplacent, et les suivre complique la recherche. Pour faire face à ce mouvement, le laboratoire de Thomas Barker – également dans le département Coulter – a utilisé de la fibronectine à micro-motifs sur du verre pour créer des « îlots » de 50 microns qui contenaient les cellules pendant l'étude.
Montré est une image optique super-résolution d'un filament viral hRSV spécifique produit avec la technologie dSTORM. Le filament viral mesure environ 4 microns de long, typique du hRSV. Crédit :Eric Alonas et Philip Santangelo
Parmi les mystères que les chercheurs aimeraient résoudre, il y a celui de savoir pourquoi certaines cellules pulmonaires sont gravement infectées, tandis que d'autres semblent échapper aux effets néfastes.
"Si vous regardez un champ de cellules, vous voyez d'énormes différences d'une cellule à l'autre, et c'est quelque chose qui n'est pas compris du tout, " a déclaré Santangelo. " Si nous pouvons comprendre pourquoi certaines cellules explosent avec le virus alors que d'autres ne le sont pas, peut-être pouvons-nous trouver un moyen d'aider les mauvais à ressembler davantage aux bons."
En plus de ceux déjà mentionnés, l'équipe de recherche comprenait James Crowe, professeur de pédiatrie à l'Université Vanderbilt; Elizabeth Wright, professeur adjoint à la faculté de médecine de l'université Emory ; Daryll Vanover, Jeenah Jung, Chiara Zurla, Jonathan Kirschmann, Vincent Fiore, et Alison Douglas du département de génie biomédical Wallace H. Coulter de Georgia Tech et de l'Université Emory; Aaron Lifland et Manasa Gudheti de Vutara Inc. à Salt Lake City, et Hong Yi de la faculté de médecine de l'Université Emory.
L'un des défis de l'étude du VRS est de maintenir son activité en laboratoire – un problème que les parents de jeunes enfants ne partagent pas.
« Quand vous manipulez ce virus en laboratoire, il faut toujours faire attention à ce qu'il perde son infectiosité, " a noté Santangelo. " Mais si vous prenez une pièce pleine d'enfants qui n'ont pas été infectés et laissez un enfant infecté entrer dans la pièce, 15 minutes plus tard, tous les enfants seront infectés."
