La microscopie à force atomique (AFM) offre une méthode d'imagerie sans étiquette de la dynamique biomoléculaire à l'échelle nanométrique pour résoudre des questions biologiques qui ne peuvent être résolues par d'autres méthodes de bioimagerie, notamment la fluorescence et la microscopie électronique à balayage. Comme de telles méthodes d'imagerie ne sont possibles que pour des systèmes biologiques extraits de cellules ou reconstruits sur des substrats solides, la nanodynamique au sein des cellules vivantes reste largement inaccessible avec les méthodes de bioimagerie existantes. Dans un nouveau rapport maintenant publié dans Science Advances , Marcos Penedo et une équipe de recherche en Nanolife Science et biotechnologie à l'Université de Kanazawa au Japon, ont dépassé les limites de la bioimagerie en utilisant la nanoendoscopie-AFM. Au cours du processus, ils ont inséré une sonde en forme d'aiguille dans une cellule vivante pour présenter la fibre d'actine, des cartes tridimensionnelles (3D) et la nanodynamique 2D de l'échafaudage interne de la membrane avec des changements indétectables dans la viabilité cellulaire. Contrairement aux méthodes AFM antérieures, la nanosonde a directement accédé aux composants intracellulaires cibles et a exploré les capacités de l'AFM, y compris l'imagerie haute résolution, la cartographie nanomécanique et la reconnaissance moléculaire pour élargir la gamme observable des structures intracellulaires dans les cellules vivantes.

Dynamique intracellulaire en bioimagerie

La dynamique à l'échelle moléculaire des composants intracellulaires donne un aperçu des mécanismes fondamentaux des fonctions cellulaires et de la maladie. Cependant, les méthodes d'imagerie directe pour une telle nanodynamique dans les cellules vivantes sont difficiles. Par exemple, alors que la microscopie électronique est utile pour imager des nanostructures de cellules congelées dans le vide, elles sont incapables d'imager la nanodynamique dans des cellules vivantes dans des environnements physiologiques, sauf sous forme d'instantanés statiques de conformations fixes. De même, alors que la microscopie à fluorescence via le marquage par fluorescence fournit une méthode puissante pour visualiser la dynamique des protéines et des organites dans les cellules vivantes, elles sont limitées par une incapacité à imager efficacement à l'échelle nanométrique. Il existe donc de fortes demandes pour une méthode d'imagerie intracellulaire sans étiquette dans des environnements liquides. La microscopie à force atomique (AFM) est un candidat potentiel pour le rôle avec la capacité d'imager à l'échelle sub-nanométrique pour visualiser la nanodynamique des lipides, des protéines et des ADN sans marqueurs. Cependant, de telles images ne sont pas représentatives de systèmes biologiques résultant d'une extraction à partir d'une cellule ou d'une reconstruction sur un substrat solide in vitro. Dans ce travail, donc, Penedo et al. a proposé une méthode d'imagerie basée sur l'AFM connue sous le nom de nanoendoscopie-AFM pour observer la nanodynamique à l'intérieur des cellules vivantes sans les étiqueter ni les briser.

Expériences de nanoendoscopie-AFM

Au cours des expériences, un peu comme une caméra endoscopique, les chercheurs ont inséré une longue nanosonde en forme d'aiguille à l'intérieur d'une cellule vivante pour effectuer une imagerie AFM 2D et 3D. L'équipe a montré comment la nanoendoscopie-AFM offrait un avantage unique pour l'imagerie de cellules vivantes intracellulaires sans étiquette à l'échelle nanométrique. La méthode fournit une voie puissante pour observer des phénomènes jusqu'ici inexplorés dans les systèmes biologiques. Penedo et al. introduit à plusieurs reprises la nanosonde à l'intérieur de la cellule à différentes positions de la zone souhaitée via des mesures de courbe de force en fonction de la distance. Afin d'imager la cellule entière, la nanosonde devait être suffisamment longue pour pénétrer complètement dans la cellule jusqu'à ce qu'elle atteigne le substrat, et avec des diamètres inférieurs à 200 nm pour minimiser les dommages cellulaires, tout en facilitant la pénétration de la membrane. L'équipe a utilisé une pointe tétraédrique en silicium commerciale comme nanosonde, qu'elle a broyée à l'aide d'un broyage par faisceau d'ions focalisé aux dimensions préférées. L'équipe a ensuite utilisé les nanosondes dans différentes zones d'une cellule HeLa. Ils ont acquis une image nanoendoscopie-AFM 3D d'une cellule entière au cours des expériences et ont identifié le noyau de la cellule HeLa du reste de la cellule. D'autres mesures ont également indiqué les structures granulaires internes. Pour minimiser les dommages cellulaires lors de la pénétration, Penedo et al. réduit autant que possible la force de pénétration et la longueur d'indentation. Ils ont également mené des expériences de viabilité cellulaire pour confirmer que la nanoendoscopie-AFM 3D n'entraînait pas de dommages cellulaires graves lors de l'utilisation de nanosondes d'un diamètre inférieur à 200 nm. À l'aide de la nanoendoscopie-AFM 3D, ils ont facilité l'imagerie du cytosquelette interne dans les cellules vivantes pour observer l'organisation 3D des fibres non supportées. L'équipe a également fusionné avec succès des images intracellulaires issues de la nanoendoscopie-AFM 3D et de la microscopie confocale.

Nanoendoscopie-AFM 2D

La possibilité d'insérer plusieurs fois une longue nanosonde dans une cellule tout en maintenant la viabilité cellulaire impliquait la possibilité de localiser l'apex de la sonde dans une cellule vivante pour effectuer des mesures AFM 2D/3D locales sans dommages substantiels. La nanosonde pourrait être insérée dans la cellule pour mesurer le côté cytoplasmique de la membrane cellulaire via le mode de modulation d'amplitude AFM. Les nanosondes devaient être suffisamment longues pour pénétrer complètement dans la cellule et atteindre son fond, tout en étant suffisamment fines pour réduire les dommages cellulaires. Pour y parvenir en pratique, Penedo et al. ont développé des nanosondes en carbone amorphe en utilisant le dépôt par faisceau d'électrons et ont mesuré la dépendance de l'amplitude à la distance, pour déterminer l'intégrité de la cellule. Ils ont réalisé des expériences de nanoendoscopie-AFM 2D en utilisant une cellule de fibroblaste pour illustrer la structure réticulaire de la membrane cellulaire interne et ont observé l'architecture cellulaire pour étudier la dynamique interne des structures cellulaires. Les travaux ont mis en évidence la possibilité d'utiliser la nanoendoscopie-AFM 2D pour étudier la nanodynamique des structures internes des cellules vivantes dans des environnements physiologiques.

Perspectives

De cette façon, Marcos Penedo et ses collègues ont montré les applications de la nanoendoscopie-AFM pour mesurer les surfaces internes cytoplasmiques des membranes cellulaires et des échafaudages associés afin de comprendre l'arrangement 3D des filaments d'actine dans leur environnement intracellulaire naturel dans les cellules vivantes. L'équipe a cherché à minimiser les dommages cellulaires en utilisant des nanosondes ultrafines en forme d'aiguille dans les expériences. Les méthodes AFM proposées ont produit des cartes 3D des structures cellulaires internes en plus des projections 2D combinées aux méthodes de fluorescence existantes telles que la microscopie confocale ou à super-résolution. La méthode permettra d'éclairer la machinerie cellulaire en action, in vivo, tout en exposant des moteurs moléculaires physiologiques. La méthode ouvrira également de nouvelles possibilités pour étudier la nanomécanique intracellulaire qui joue un rôle important dans les fonctions cellulaires. L'équipe peut utiliser la méthode pour mesurer les caractéristiques de rigidité, d'adhérence et de dissipation du noyau afin d'extraire des informations biologiques adaptées aux domaines interdisciplinaires de la biologie cellulaire et de la médecine. + Explorer plus loin

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