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  • L'imagerie en temps réel montre comment le SRAS-CoV-2 attaque les cellules humaines

    QD608-RBD se lie à l'ACE2 et induit l'endocytose. Dans cette figure, le panneau supérieur montre ACE2-GFP (jaune) exprimant des cellules se liant et internalisant QD608-RBD (magenta). Dans le panneau du bas, un inhibiteur est ajouté pour empêcher la liaison de QD608-RBD à ACE2-GFP, et la présence d'ACE2-GFP sur la surface cellulaire est forte avec peu ou pas de QD608-RBD visible. Crédit :NCATS

    "Ce que nous faisons ici est en fait de visualiser la liaison de la pointe à l'ACE 2 [enzyme de conversion de l'angiotensine 2], " déclare Kirill Gorshkov, chercheur au National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) dans le Maryland, NOUS.

    Aussi inoffensif que cela puisse paraître aux non-initiés, cette liaison est la première étape d'un processus de prolifération virale qui a peut-être conduit à la pire pandémie de mémoire d'homme. Le "spike" est une protéine du virus SARS-CoV-2 qui est largement reconnue comme la principale arme d'attaque pour mobiliser son ADN viral dans une cellule hôte. Les récepteurs ACE2 sont des protéines cellulaires humaines qui ouvrent effectivement la porte à cette attaque. En utilisant des points quantiques issus de la bio-ingénierie, Gorshkov et Eunkeu Oh au Naval Research Laboratory (NRL) à Washington, D.C., et leurs collègues ont pu imager la liaison et l'internalisation ultérieure qui se produisent lorsque l'ACE2 et la protéine de pointe interagissent. "Vous pouvez réellement voir cela se produire en temps réel, " ajoute Gorshkov, "C'est la beauté de ce test et c'est pourquoi nous pensons qu'il sera important pour le dépistage des médicaments."

    Un virus ne peut pas se reproduire sans enrôler une cellule hôte, les chercheurs du monde entier ont donc travaillé pour comprendre comment le SARS-CoV-2 interagit et pénètre dans les cellules dans le but de bloquer cette étape et d'empêcher l'apparition de COVID19. Gorshkov et ses collègues du NCATS travaillaient déjà sur divers tests d'imagerie pour les cancers, virus et maladies de surcharge lysosomale, "mais quand le coronavirus a frappé, nous avons rapidement dû changer de vitesse, " dit Gorchkov.

    Des recherches antérieures sur le SRAS avaient mis en évidence l'importance des interactions avec l'ACE2 dans les cellules humaines pour la propagation de ce type de virus, et ils étaient déjà capables de marquer ces protéines réceptrices avec une protéine fluorescente verte pour imager leurs mouvements. Les preuves s'accumulaient également pour identifier les protéines de pointe spécifiques sur le SRAS-CoV-2 qui pourraient verrouiller ACE2 dans une forteresse afin que le virus puisse entrer dans la cellule. Cependant, les informations sur les interactions entre les protéines de pointe proviennent principalement d'analyses et de tests biochimiques ou de proximité avec des protéines et des parties de protéines extraites du virus - "pseudo-viro-particules". Sans marquage fluorescent de ces protéines virales, leur rôle dans la liaison au récepteur ACE2 et l'internalisation ultérieure - l'endocytose - a continué à jouer efficacement sous le couvert de l'obscurité de l'imagerie.

    Chez LNR, les chercheurs souhaitaient également tirer parti de leur expertise avec les nanoparticules pour l'administration cellulaire et la biodétection pour aider les efforts de recherche de médicaments anti-COVID19. Oh a commencé à chercher des façons possibles d'appliquer les techniques de conjugaison protéine-nanostructure avec lesquelles elle travaillait depuis plus de 15 ans. Avec deux protéines qui partagent une affinité de liaison - un point quantique attaché à l'une et une nanoparticule fluorescente attachée à l'autre - la liaison entre les deux protéines rapprochera alors les nanostructures suffisamment pour le transfert d'énergie entre elles.

    L'extinction de fluorescence qui en résulte permet ensuite aux chercheurs de surveiller la liaison aux protéines. "Si vous avez un inhibiteur au milieu pour arrêter la liaison, cela peut être utilisé comme test d'inhibition pour le criblage de médicaments, donc nous l'utilisons beaucoup, " explique Oh. Voyant l'application potentielle pour le dépistage des anticorps contre COVID19, Oh et son équipe dirigée par Mason Wolak ont ​​présenté leurs idées à l'équipe du NCATS, et les deux institutions se sont immédiatement mises au travail pour le développer davantage.

    Développer un "pseudovirion"

    La première étape du côté d'Oh de la collaboration consistait à développer un "pseudovirion" avec les parties puissantes des protéines de pointe du SRAS-CoV-2 (où se trouve le domaine de liaison au récepteur) attachées au point quantique de telle sorte que les protéines de pointe continuer à attaquer et à pénétrer les cellules comme un virus actif. Pour ça, l'orientation des protéines de pointe et la forme du pseudovirion étaient essentielles, et ici, La vaste expérience de Oh dans la conjugaison de protéines actives à des nanostructures a porté ses fruits. Avant de passer aux tests de livraison cellulaire plus coûteux, ils ont dû tester si leur pseudovirion fonctionnait à l'extérieur des cellules en conjuguant des nanoparticules d'or fluorescentes aux récepteurs ACE2 et en surveillant l'extinction de la fluorescence. Oh répertorie les multiples ratios protéine/point quantique, les tailles de points quantiques et les chimies de surface qu'ils ont essayées avant de pouvoir enfin observer l'extinction de la fluorescence sur la liaison aux protéines, et étaient prêts à envoyer le pseudovirion à l'équipe de Gorshkov "pour faire des trucs sympas avec la vraie cellule".

    Pour observer le pseudovirion interagir avec ACE2 dans une cellule réelle, le point quantique sur le pseudovirion devait maintenant être conçu pour émettre à une longueur d'onde facile à distinguer de la protéine fluorescente verte sur ACE2, par opposition à l'optimisation de la trempe des nanoparticules. Avec les deux signaux clairs, l'équipe du NCATS a pu suivre la liaison des deux protéines et l'endocytose ultérieure. En outre, ils ont pu voir que la liaison et l'endocytose étaient empêchées en présence de deux anticorps tests. Ils pourraient même tester le mécanisme d'endocytose, qui procède au moyen d'une protéine nommée dynamine. Quand ils ont ajouté Dyngo-4a, qui interrompt la dynamine, ils pouvaient voir la liaison se produire mais pas d'endocytose ultérieure.

    Les résultats témoignent également d'un succès pour les collaborations de recherche à distance, car les équipes ne se sont jamais rencontrées. "Le type de collaboration que nous avons ici est rare, " dit Gorchkov, reflétant à quel point leurs progrès ont dépassé les collaborations précédentes où il y avait eu un plus grand nombre de réunions physiques et d'activités coordonnées. "Il y avait une telle motivation et une telle concentration de la part des deux groupes que cela a vraiment très bien fonctionné."

    Le pseudovirion à points quantiques est limité à l'imagerie de la pénétration cellulaire par endocytose, et il reste à déterminer si ce mécanisme entre en vigueur pour tous les types cellulaires, tissu pulmonaire en particulier. Un mécanisme d'attaque alternatif du SARS-CoV-2 est basé sur la fusion membranaire, et l'imagerie avec le pseudovirion à points quantiques nécessiterait des modifications importantes pour interagir avec la cellule davantage comme une membrane. Cependant, le débit rapide et les observations directes que permet le pseudovirion à points quantiques devraient présenter des avantages significatifs dans la recherche d'anticorps.

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